![]()
细菌内毒素（Endotoxin），是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，单体的分子量为5 000～25 000道尔顿，是由亲水性的多糖O抗原、核心多糖和亲脂性的类脂A(lipid A)共同构成的一种两性大分子。脂多糖在极性溶剂和非极性溶剂中均能形成多聚体。
细菌内毒素通过消化道进入动物体内时并不产生危害，小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。但通过注射等方式大量进入血液时，作为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等使之释放出内源性热原质，作用于体温调节中枢而引起发热、寒颤、呕吐等症状，严重者可致休克甚至死亡（热原反应）。因此，生物制品类、注射用药剂、抗生素类、疫苗等制剂以及医疗器材类必须经过细菌内毒素检验合格后才能使用。
![]()
细菌内毒素检查法（也称鲎试验法）是利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断药品或疫苗中内毒素的含量是否符合相关规定的一种方法，常用的方法有凝胶法和光度法。鲎试验因其具有灵敏、快速、重现性好、可定量测试等优点，已逐步替代家兔法，广泛用于制药、临床以及科研等领域细菌内毒素和真菌葡聚糖检测。但由于该试验是一种基于鲎试剂中的酶蛋白在模拟的生理环境下进行的反应，所以在反应过程中会受到很多生化因素的影响。此外，由于内毒素本身的特性决定了容易被吸附和集聚，所以细菌内毒素检查时经常存在干扰问题。一项对人用药物与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围，在所研究的品种中有70%的样品是存在干扰的，仅有30%成分比较简单的样品（如注射用水）可以不经过任何处理直接进行BET。因此采取一些适当的方法处理这些干扰问题，从而减少实验误差，确保检验结果的准确性和疫苗、药品的的安全使用就显得非常重要。以下就对细菌内毒素检验中常见的干扰类型和消除方法进行简要介绍。
1.《中国兽典药》（2015年版）规定无干扰的条件
使用鲎试验方法对任何样品检查前，必须充分验证该样品对试验无干扰作用，这样检测结果才视为有效。
当溶液A（供试品溶液）和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C（含2λ、λ、1/2λ、1/4λ内毒素标准品溶液）的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验时，试验方为有效。
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
供试品溶液回收率在50%～200%为无干扰；回收率＜50%为抑制；回收率＞200%为增强。不仅可判断是否有干扰，还可以判断干扰的类型是抑制还是增强。
供试品的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度（凝胶法），但检测结果仍为阴性（也称假阴性）；光度测定法供试品的内毒素检测值小于实际值（回收率＜50%），称之为抑制。
抑制的结果使得内毒素不合格的原辅料用于生产、中间品进入下一道工序，潜在热原的产品可能被放行到市场中，致使动物发病、死亡造成养殖户的损失甚至重大动物疫苗质量事故。
供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂的灵敏度1/2（凝胶法），但检测结果仍为阳性（称之为假阳性）；光度测定法供试品的内毒素检测值大于实际值（回收率＞200%），称之为为增强。
增强的结果使得内毒素合格的原辅料不能用于生产、中间品不能进入下一道工序，直接导致产品报废，造成很大浪费和不必要的经济损失。
来自样品中的主成分、辅剂、甚至一些杂质，可能对鲎试剂或内毒素形成干扰。因为鲎试剂是一种酶，酶对反应环境有一些比较苛刻的条件，样品中的成分如果影响到酶的活性，可能影响鲎试剂的活性而形成干扰。内毒素是高纯度的脂多糖，样品或其它试验因素如果影响到内毒素的活性或影响内毒素的结构，也可以对鲎试验产生抑制或增强作用。
鲎试剂中的酶需要pH值在6～8范围内才能达到最佳的反应活性，极端的pH环境会影响酶的活性或使酶失活，造成抑制，通常表现为假阴性。一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲对以帮助样品的pH值的调节，如使用鲎试剂生产厂家的pH缓冲液，测定以1:1为比例的样品稀释液+鲎试剂的混合液，就可以将pH值为3的盐酸调整为pH值为7。
《中国兽典药》2010年版要求“供试品溶液的pH值为6.0～8.0的范围”，而在《中国兽典药》2015年版改为“供试品和鲎试剂混合液的pH值为6.0～8.0的范围”，这样在描述上显得更加科学。因此，在测试pH值时，应测定以1:1为比例混合的供试品稀释液和鲎试剂混合溶液的pH值。
但仅通过鲎试剂添加缓冲对并不足以解决所有样品的pH值问题，若供试品本身具有极强的缓冲能力或样品pH比较极端时，应采用以下方法进行pH的调节：
①用BET水（细菌内毒素检测用水）尝试在供试品允许的范围内进行稀释。
②用pH缓冲液如Tris（三羟甲基氨基甲烷）或Hepes（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）制备或稀释供试品。
③用酸（盐酸）、碱（氢氧化钠）或缓冲液来调节pH值。但酸、碱浓度不宜太高（最好不宜要超过0.1mol/L），因为酸、碱浓度太高会水解内毒素，对样品本身内毒素造成破坏而形成新的干扰。
供试品中含有的螯合剂（如EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物等）成分会螯合鲎试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），Mg2+是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg2+，内毒素就无法激活鲎试剂的酶，从而造成抑制，表现为假阴性。解决方法：①用BET水在供试品允许的范围内进行稀释。②使用含Mg2+离子或Ca2+离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂的含量。但要注意过高的二价阳离子（如Ca2+）浓度可能会带来新的干扰，形成抑制。
过高浓度的盐或糖溶液通常会抑制鲎试剂反应，如50%的葡萄糖或5%的氯化钠溶液。高渗透压的溶液会从鲎试剂吸水，从而使酶失活，造成抑制，形成假阴性反应。
解决方法：①用BET水的在供试品允许的范围内进行稀释可消除干扰。②5%的氯化钠溶液可稀释成生理盐水（0.9%）后进行检测。
鲎试剂的凝固酶属于一种丝氨酸蛋白酶，供试品中若含有类似的丝氨酸蛋白酶（常见于血液制品）会导致激活鲎试剂的反应，造成增强，形成假阳性反应。
一些人血浆制品（如人血白蛋白、静注用IgG等），作为原料的血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制LAL凝固酶与内毒素的活性反应，造成抑制，形成假阴性反应。
对酶、酶抑制剂带来的干扰较为简单的一种消除干扰的方法是：将供试品用BET水稀释10倍，然后使用75℃加热10分钟，使其中的酶或蛋白失活。但要注意该方法对血液制品有用，但并不是对所有的样品都适应。
内毒素标准品是提纯的内毒素，是高纯度的脂多糖、杂质很少，因此没有自然存在的内毒素稳定（环境内毒素除含有内毒素脂多糖之外，还有一些细胞碎片、糖蛋白、脂类的包裹而非常稳定），溶解后放置时间太长，会失活造成效价下降；内毒素分子的两亲性又使其容易自身聚集成团，成为更大的分子，三维结构改变也会导致其效价下降，造成抑制。
解决方法：
①按内毒素标准品说明书要求制备新鲜标准品溶液。
②如果内毒素标准品需要储存，必须验证其储存条件是否会影响其活性。有些进口内毒素溶解后在可在原瓶2～8℃放置28天。
③经常旋涡含有标准内毒素的溶液，比如10分钟旋涡一次。供试品和标准品每次稀释或加样时，均要旋涡至少30秒。
脂多糖的两亲性会使其对一些具有疏水集团的产品具有亲和力（如脂类、磷脂、脂蛋白、大分子量血浆蛋白），脂多糖与这些产品的结合会使其大小和形状受到影响，以至于影响活性，使内毒素试验受到干扰，形成抑制。
解决方法：使用内毒素分散剂（如高聚磷酸酯活性剂）稀释样品可以使内毒素从供试品中分离出来，恢复内毒素的活性。
![]()
不是任何器具都适用于内毒素检测，一些试验器具（如塑料制品）会对内毒素有吸附作用而造成抑制。因此应首选硼硅酸盐玻璃的稀释管、反应管、刻度吸管，一次性器具应选择聚苯乙烯，尽可能不要用聚丙烯材料，它会加剧内毒素的损耗（吸附内毒素）。同还要提防有些塑料包装溶出物带来的干扰。
非内毒素反应物（LAL-RM）不是内毒素，不会引起热原反应，但它会激活鲎试剂中的G因子形成反应，造成假阳性，形成增强。β-葡聚糖是造成鲎试验结果假阳性的一个已知来源。日常使用的酒精棉、纱布、滤膜、纤维素类制品等都会带来含有β-葡聚糖的成分。
用鲎试剂生产厂家的抗增液复溶鲎试剂可以消除大多数的葡聚糖干扰。
无论是生产工艺上使用的洗涤剂（表面活性剂），还是试验器具上残留的洗涤剂都会对鲎试验造成干扰。不仅会作用于鲎试剂，也会作用于内毒素；有可能带来抑制，也有可能形成抑制。
高浓度的洗涤剂使鲎试剂的蛋白变性，失去活性，形成抑制。
某些洗涤剂（如脱氧胆酸）会将内毒素分散为脂多糖的单体（约20.000道尔顿），这些单体是无毒性并且不会激活鲎试剂，但去除洗涤剂后，内毒素活性恢复。
弱的非离子型表面活性剂（比如吐温-20或吐温-80等），和其它阳离子洗涤剂会分解内毒素的三维结构，内毒素变成小分子，毒性中心暴露面积增加从而增加其效价，形成增强作用。
解决洗涤剂、表面活性剂问题：
①用大量的水彻底清洗器具，确保器具无洗涤剂残留。
②用BET水在允许范围内对供试品进行更大倍数稀释。
③试验用生理盐水稀释供试品，生理盐水可使供试品盐化，从而降低其表面活性。
![]()
以上介绍了内毒素检验时常见的干扰因素和处理方法，以及干扰对检验结果的影响。在实际检测工作中，干扰并不是某一个因素，有可能种类更多。由于口蹄疫疫苗生产需要通过细胞培养、病毒繁殖、浓缩、纯化、灭活、乳化、分装等繁琐的工艺过程，而且需要控制新生牛血清、细胞培养基等原辅材料以及注射用水，中间品、成品疫苗的细菌内毒素含量，样品种类繁多、成分复杂，干扰的来源和影响也更为广泛。因此，在建立这些样品细菌内毒素检测方法时，一定要按照《中国兽典药》2015年版进行干扰试验，同时要要注意消除干扰不能影响供试品中的内毒素，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验，充分验证该样品对试验无干扰作用后，才可用于样品的检测。对每次检测的结果，无论是凝胶法还是光度法检测，都要仔细分析，尤其对异常结果更要慎重对待，及时排除假阴性、假阳性、以及光度法中回收率不符合规定的结果，排除各种干扰后再进行检测。最好的排除干扰的方法就是用细菌内毒素检测用水对样品进行更大的稀释（但不能超过最大稀释倍数），据报道有97%的干扰问题是可以通过稀释供试品的方法去消除。如果各种措施都不能排除干扰，说明该样品不适合用鲎试验法检测，可用家兔法或其它方法检测。
![]()
