第一章 血液样本采集和血涂片制备

第一章　血液样本采集和血涂片制备

 

 

第一节　血液生理概要

　　本节要点:
　　（1）血液组成
　　（2）血液理化性质
　　（3）血液特性
　　（4）血液生理功能
　　（一）血液的组成
血液由血细胞（红细胞、白细胞、血小板）和血浆组成。离体后血液自然凝固，分离的淡黄色透明液体称为血清。血液加抗凝剂后分离出来的淡黄色液体称为血浆。血清与血浆差别是：血清缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。
　　全血适用于临床血液学检查，如血细胞计数、分类和形态学检查等。血浆适用于血浆生理性和病理性化学成分的测定，特别是内分泌激素测定；血浆除钙离子外，含有其他全部凝血因子，也适用于血栓与止血的检查。血清适用于临床化学和临床免疫学检查。
　　（二）血液理化性质
　　（基础知识，相关专业知识，了解）
1.血量：指存在于血液循环系统中全部血液的总量，相当于血浆量与血细胞量的总和。正常人血量约为70±10ml／kg体重，成人约4～5L，约占体重的6%～8%，其中血浆占55%，血细胞占45%。小儿血量与体重之比略高于成人，男性比女性血量稍多，但女性妊娠期间血量可增加23%～25%。
2.颜色：血液的红色来自红细胞内血红蛋白。动脉血氧合血红蛋白含量较高，呈鲜红色；静脉血还原血红蛋白含量高，呈暗红色。严重贫血者血液红色变浅。严重CO中毒或氰化物中毒者血液呈樱红色。餐后，尤其是高脂膳食后，血浆呈乳白色。溶血患者血浆呈红色。
3.酸碱度：随人体饮食中摄入的酸性或碱性物质、体内代谢产生的酸性物质，如乳酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、H₃P0₄、H₂S0₄等影响，血液pH波动在很小范围内。正常人血液pH为7.35～7.45，动脉血pH7.40，静脉血pH为7.35。
4.比密和渗透量
　　（1）血液比密：正常男性约为1.055～1.063，女性约为1.051～1.060，相对粘度为4～5；血浆比密约为1.025～1.030；血细胞比密约为l.090。血液比密与红细胞含量、红细胞内血红蛋白含量有关。血浆比密和血浆内蛋白浓度有关。
　　（2）血浆渗透量：正常人约为290～310mOsm／kg·H₂O。
　　（三）血液特性
1.红细胞的悬浮稳定性：正常人血液中红细胞呈均匀混悬状态。与红细胞膜表面的唾液酸根（形成Zeta电位使红细胞间相互排斥保持一定距离）、正常血浆成分、血浆粘度及血流动力学等因素有关。
2.粘滞性：正常人全血粘度约为生理盐水粘度的4～5倍，血浆粘度约为生理盐水粘度的1.6倍。血液粘度与血细胞比容和血浆粘度有关。其中，血浆粘度受血浆中纤维蛋白原、球蛋白等大分子蛋白质的影响，它们的浓度越高，血浆粘度越高。此外，血管内壁和血流动力学因素亦可影响血液粘度。
3.凝固性：通常，血液从血管取出后，在数分钟内便自行凝固，是凝血因子激活的结果。
　　（四）血液生理功能
1.运输功能：可将自肺部吸入的氧气和自消化道吸收的各种营养成分（如葡萄糖、氨基酸、矿物质等），

经过血液运输到全身各个脏器和组织，同时将各个脏器和组织产生的各种代谢产物（如C0₂、尿素等），通过血液输送到肺、肾等排泄器官排出体外。
2.协调功能：将各种激素、酶类运输到相关组织器官，实现对全身各组织器官功能活动的协调。
3.维护机体内环境稳定：通过循环与身体各部位广泛沟通，对体内水电解质平衡、酸碱平衡、体温恒定有重要作用，使机体保持一个适宜而稳定的理化环境。
4.防御功能：白细胞、抗体、补体、细胞因子具有强大免疫功能。血小板、凝血因子具有止血和凝血作用。

第二节　采血方法

　　血样本的正确采集是获得准确、可靠实验结果的关键。在样本采集前，应根据实验要求，决定采血方法、所需血量及适用抗凝剂。
　　本节要点：
　　（1）静脉采血法
　　（2）皮肤采血法
　　（3）真空采血法
　　（4）方法学评价
　　（5）质量控制
　　（一）静脉采血法
1.概述：静脉采血多采用位于体表的浅静脉，通常采用肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉。小儿可采颈外静脉血液。根据采血量可选用不同型号注射器，配备相应的针头。某些特殊检查，为避免血小板激活，要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料试管。
2.操作方法和注意事项
　　（1）患者准备：采血前应向患者耐心解释，以消除疑虑和恐惧心理。如个别患者进针时或采血后发生眩晕，应让其平卧休息。必要时可嗅吸芳香氨酊、针刺（或指压）人中和合谷等穴位。若因低血糖诱发眩晕，可立即静脉注射葡萄糖或让患者口服糖水。如有其他情况，应找医生共同处理。
　　（2）检查注射器：静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光滑、通气，针筒不漏气。
　　（3）消毒：先用30g／L碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%乙醇棉签以同样方法拭去碘迹。
　　（4）穿刺：以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，食指固定针头下座，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤，然后以5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。见回血后，将针头顺势探入少许，以免采血时针头滑出；但不可用力深刺，以免造成血肿，同时立即去掉压脉带。
　　（5）抽血：针栓只能外抽，不能内推，以免静脉内注入空气形成气栓，造成严重后果。
　　（6）放血与混匀：取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入抗凝管中，防止溶血和泡沫产生。
　　（二）皮肤采血法
1.概述：曾被称为毛细血管采血法，是采集微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，同时含细胞间质和细胞内液。通常，选择耳垂或手指部位。耳垂采血痛感较轻、操作方便，但血循环较差、受气温影响较大、检查结果不够恒定（如红细胞、白细胞、血红蛋白和血细胞比容等测定结果比手指血或静脉血高），一般情况下不宜使用。手指采血操作方便，检查结果比较恒定，世界卫生组织（WHO）推荐采集左手无名指指端内侧血液，婴幼儿可采集大拇趾或足跟内外侧缘血液，严重烧伤患者，可选择皮肤完整处采血。
　　目前可用激光无痛采指血仪采血，原理是仪器中激光发生器发出一串单脉冲激光束，在一次性耗材（镜

头片）的配合下，细微的光束打在手指上，在很短时间内使皮肤组织溶解、挥发，出现一个小孔，而打孔后的残留物成等离子状态，吸附在镜头片表面。仪器采血有效地避免了皮肤浅层组织液、细胞外液等渗入血液，确保检测结果准确，同时也可消除交叉感染，达到无痛采血的效果。
2.操作方法和注意事项
　　（1）所选择采血部位的皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。除特殊情况外，不要耳垂采血。
　　（2）本试验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性器材。
　　（3）皮肤消毒后，应待75%乙醇挥发后采血，否则流出的血液扩散而不成滴。
　　（4）采血时，先应按摩左手中指或无名指指端内侧，使局部组织自然充血。针刺深度2～3mm。
　　（5）因第1滴血混有组织液，应擦去。如血流不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。
　　（6）进行多项检查时，采血的顺序依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血型鉴定等。
　　（三）真空采血法
　　又称为负压采血法。真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。封闭式采血无需容器之间的转移，减少了溶血现象，能有效保护血液有形成分，保证待验样本原始性状的完整性，使检验结果更可靠，同时，样本转运方便，能有效避免医护人员和患者间交叉感染。各种真空定量采血容器，根据需要标有不同的色码，适于不同检验项目（表1-1-1）。

（四）方法学评价
1.皮肤采血：缺点是易于溶血、凝血、混入组织液，而且局部皮肤揉擦、针刺深度不一、个体皮肤厚度差异等都影响检查结果，所以，皮肤采血检查易发生凝块，结果重复性差、准确性不好。
2.静脉采血：开放式采血法的操作环节多、难于规范统一，在移液和丢弃注射器时可能造成血液污染。封闭式采血法的操作规范，有利于样本收集运送和保存，防止院内血源性传染病。
　　（五）质量控制
1.患者：患者活动情况、精神状态、药物、年龄、性别、种族、样本采集时间、吸烟、季节等都会影响检测结果。如正常人一日之间，白细胞数、嗜酸性粒细胞数、血小板数等均有一定的波动。
2.采血：采血前，患者应尽量减少运动保持平静。住院患者应在早晨卧床时取血。冬天，患者从室外进入室内，应等其暖和后再采血。止血带结扎时间超过2分钟，大静脉血流受阻而使毛细血管内压增高，血管内液与组织液交流，使分子质量<5000的物质逸入组织液，或缺氧引起血液成分的变化，使检查结果增高或减低。
3.溶血：血细胞内、外各种成分有梯度差，有的成分相差数10倍（表1-1-2），故在采集、运输、保管、分离血细胞时应尽量避免溶血。因容器不洁、接触水、强力振荡、操作不慎等可引起溶血，使红细胞计数、血细胞比容、血浆或血清化学成分（如钾、镁、转氨酶、胆红素）等多项指标检验结果增高或减低，不能确切反映原始标本的实际含量。

4.样本处理：血液样本采集后应立即送检，并尽快进行检查，样本保存不当直接影响实验结果。血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。低温（4℃）保存血液可使血小板计数结果减低。因此，应根据实验项目确定最佳的保存条件。
5.结果分析：分析结果时，应考虑药物、饮食等因素对结果的影响。同时，应密切结合临床。如患者有严重腹泻或呕吐时，红细胞计数可因脱水而相对性增高。

第三节　抗凝剂选择 

　　本节考点：
1.抗凝剂选择
　　抗凝是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固。能够阻止血液凝固的物质，称为抗凝剂或抗凝物质。

一、常用抗凝剂和使用方法如下
1.乙二胺四乙酸（EDTA）盐：常用有钠盐（EDTA-Na₂·H₂0）或钾盐（EDTA-K₂·2H₂O），能与血液中钙离子结合成螯合物，使Ca²⁺失去凝血作用，阻止血液凝固。根据国际血液学标准化委员会（ICSH）建议，CBC抗凝剂用量为EDTA-K₂·2H₂O，量为1.5～2.2mg／ml血液。不适于凝血检查、血小板功能试验。
2.草酸盐：常用有草酸钠、草酸钾、草酸铵，溶解后解离的草酸根离子能与样本中钙离子形成草酸钙沉淀，使Ca²⁺失去凝血作用，阻止血液凝固。2mg草酸盐可抗凝1ml血液。但不适于凝血检查。而且，草酸盐浓度过高还会导致溶血、改变血液pH，干扰血浆钾、钠、氯和某些酶活性的测定。
　　双草酸盐抗凝剂：适用于血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查，不适于血小板计数、白细胞分类计数。
3.肝素：是加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，从而阻止血液凝固。肝素是红细胞透渗脆性试验的理想抗凝剂。但不适于CBC、细胞形态学检查。每毫升血液肝素用量为（15±2.5）U，多为肝素钠盐或钾盐。
4.枸橼酸盐：常用有枸橼酸钠，能与血液中钙离子结合形成螯合物，阻止血液凝固。枸橼酸盐抗凝剂的抗凝力不如上述抗凝剂。枸橼酸钠与血液的抗凝比例为1：9或1：4。适用于红细胞沉降率、凝血检查，是输血保养液的成分。

习题1.红细胞脆性试验的首选抗凝剂是
A.EDTA-K₂
B.拘橼酸钠
C.草酸钠
D.肝素
E.双草酸盐

[答疑编号500725010201]

	『正确答案』D

第四节　血涂片制备

　　本节考点：
　　（1）载玻片的清洁
　　（2）血涂片的制备

一、玻片的清洁
　　新载玻片常带有游离碱质，必须以1mol／L HCl浸泡，清洗。载玻片应清洁、干燥、中性、无油腻。

二、血涂片的制备
1.手工推片法：影响涂片厚薄的因素有：血滴大小、推片与载玻片间夹角（25°-30°）、推片速度、血细胞比容。一张良好的血片，应厚薄适宜、头体尾明显、细胞分布均匀、血膜边缘整齐、并留有一定空隙。
2.载玻片压拉法：适用于血细胞活体染色。
3.棕黄层涂片法：适用于白细胞减低患者的白细胞分类计数、红斑狼疮细胞检查等。

图1 血涂片制备 

一般良好的涂片是：厚薄适宜，头体尾分明，细胞分布均匀，边缘整齐，两边和两端留有空隙各0.3cm和0.5cm，血膜占血片的2/3。

 

第五节　细胞染色 

　　本节考点：
　　（1）瑞氏染色法
　　（2）吉姆萨染色法
　　血涂片在用光学显微镜观察前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。染色是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。
　　血涂片染色方法大多源自罗氏染色法，常用瑞氏染色法、姬姆萨染色法。

一、瑞氏染色法
1.瑞氏染料
　　由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。
2.染色原理
　　既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。
3.pH的影响 （pH6.4～pH6.8）
　　细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。
4.染色方法和注意事项
　　（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。
　　（2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。
　　（3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
　　（4）瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，Ⅱ液为磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）。

二、姬姆萨染色法
1.染色原理
　　姬姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色基本相同。
2.染色方法和注意事项
①需先用甲醇固定3～5分钟。
②姬姆萨染液由姬姆萨染料、甘油和甲醇组成。染色前，用磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）稀释姬姆萨染液10～20倍。
　　习题2：以下哪项对瑞特染色效果影响最大（　）。
A.染色液pH
B.染色前血涂片是否干燥
C.细胞数量
D.冲洗时是否先倒去染液再冲洗
E.染色时间和室温

[答疑编号500725010202]

『正确答案』A 『答案解析』染色液pH对细胞染色效果影响很大，由于细胞内许多成分为蛋白质，而蛋白质为两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与染液中伊红（酸性染料）结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与染液中美蓝或天青（碱性染料）结合，染色偏蓝。因此，染液的pH应恒定在6.4-6.8之间。配制染液时必须使用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗染片必须用中性水。否则染色异常，形态难以识别。

　　习题3：关于瑞特染色的叙述，下列那项是错误的（　）。
A.甲醇的作用是溶解美蓝和伊红，固定细胞形态
B.是酸性染料美蓝和碱性染料伊红组成的复合染料
C.缓冲液的pH值对细胞着色有较大的影响
D.新鲜配制的染料需放置一段时间后才能使用
E.染色时间受室温的影响

[答疑编号500725010203]

『正确答案』B

　　习题4：Wright染色后结果偏酸，可出现以下那种情况（　）。
A.所有细胞染灰蓝色
B.嗜酸粒细胞、嗜酸性颗粒染成暗褐色
C.白细胞核呈浅蓝色或不着色
D.嗜中性颗粒染成紫黑色
E.淋巴细胞染成黑色

[答疑编号500725010204]

『正确答案』C 『答案解析』在偏酸环境中，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；而在偏碱性环境中，所有细胞呈灰蓝色、颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色。中性颗粒偏粗，呈紫黑色。

第六节　方法学评价 

　　本节考点：
　　（1）血涂片制备
　　（2）血液细胞染色

一、血涂片制备
　　手工推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。棕黄层涂片法可提高异常情况的阳性检出率。此外，疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血涂片法。离心涂片法，可获得分布均匀、形态完好的细胞涂片。

二、血液细胞染色
　　瑞氏染色法是最经典、最常用染色法，尤其对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染液对细胞核、寄生虫（如疟原虫等）着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采用瑞氏-姬姆萨复合染液可使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
　　瑞氏染料的质量规格用吸光度比值（rA）来评价，rA测定方法：取瑞氏染液15～25μl，加甲醇10ml稀释，混匀，以甲醇为空白管，分别在波长650nm（美蓝吸收峰波长）、525nm（伊红吸收峰波长）测定吸光度（rA=A650／A525）。新配制染料rA接近2，随美蓝逐渐氧化为天青B（其吸收峰为650nm，吸光度约为美蓝一半），rA也下降，降到1.3±0.1时，染料即可使用。新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待美蓝逐渐变为天青B，贮存时间愈久，染色效果愈好。在贮存过程中，必须加塞，以防甲醇挥发（如加甘油）和氧化成甲酸，所用甲醇须为AR级，若其中含过多丙酮，会使染色偏酸，白细胞着色不良。

第七节　质量控制 

　　本节考点：
　　（1）血涂片制备
　　（2）血液细胞染色

一、血涂片制备
　　制备涂片时，血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。血细胞比容增高、血液粘度较高时，应采用小血滴、小角度、慢推，可得满意结果；血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。

二、血液细胞染色
染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH密切相关。过深纠正方法是缩短染色时间、稀释染液、调节pH，过浅纠正方法是延长染色时间、调节pH。