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第一章 血液样本采集和血涂片制备

2020-11-13 14:02:22

第一章 血液样本采集和血涂片制备

 

 

第一节 血液生理概要


  本节要点:
  (1)血液组成
  (2)血液理化性质
  (3)血液特性
  (4)血液生理功能
  (一)血液的组成
血液由血细胞(红细胞、白细胞、血小板)和血浆组成。离体后血液自然凝固,分离的淡黄色透明液体称为血清。血液加抗凝剂后分离出来的淡黄色液体称为血浆。血清与血浆差别是:血清缺少某些凝血因子,如凝血因子Ⅰ(纤维蛋白原)、Ⅱ(凝血酶原)、Ⅴ、Ⅷ等
  全血适用于临床血液学检查,如血细胞计数、分类和形态学检查等。血浆适用于血浆生理性和病理性化学成分的测定,特别是内分泌激素测定;血浆除钙离子外,含有其他全部凝血因子,也适用于血栓与止血的检查。血清适用于临床化学和临床免疫学检查。
  (二)血液理化性质
  (基础知识,相关专业知识,了解)
1.血量:指存在于血液循环系统中全部血液的总量,相当于血浆量与血细胞量的总和。正常人血量约为70±10ml/kg体重,成人约4~5L,约占体重的6%~8%,其中血浆占55%,血细胞占45%。小儿血量与体重之比略高于成人,男性比女性血量稍多,但女性妊娠期间血量可增加23%~25%。
2.颜色:血液的红色来自红细胞内血红蛋白。动脉血氧合血红蛋白含量较高,呈鲜红色;静脉血还原血红蛋白含量高,呈暗红色。严重贫血者血液红色变浅。严重CO中毒或氰化物中毒者血液呈樱红色。餐后,尤其是高脂膳食后,血浆呈乳白色。溶血患者血浆呈红色。
3.酸碱度:随人体饮食中摄入的酸性或碱性物质、体内代谢产生的酸性物质,如乳酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、H3P04H2S04等影响,血液pH波动在很小范围内。正常人血液pH为7.35~7.45,动脉血pH7.40,静脉血pH为7.35。
4.比密和渗透量
  (1)血液比密:正常男性约为1.055~1.063,女性约为1.051~1.060,相对粘度为4~5;血浆比密约为1.025~1.030;血细胞比密约为l.090。血液比密与红细胞含量、红细胞内血红蛋白含量有关。血浆比密和血浆内蛋白浓度有关。
  (2)血浆渗透量:正常人约为290~310mOsm/kg·H2O。
  (三)血液特性
1.红细胞的悬浮稳定性:正常人血液中红细胞呈均匀混悬状态。与红细胞膜表面的唾液酸根(形成Zeta电位使红细胞间相互排斥保持一定距离)、正常血浆成分、血浆粘度及血流动力学等因素有关。
2.粘滞性:正常人全血粘度约为生理盐水粘度的4~5倍,血浆粘度约为生理盐水粘度的1.6倍。血液粘度与血细胞比容和血浆粘度有关。其中,血浆粘度受血浆中纤维蛋白原、球蛋白等大分子蛋白质的影响,它们的浓度越高,血浆粘度越高。此外,血管内壁和血流动力学因素亦可影响血液粘度。
3.凝固性:通常,血液从血管取出后,在数分钟内便自行凝固,是凝血因子激活的结果。
  (四)血液生理功能
1.运输功能:可将自肺部吸入的氧气和自消化道吸收的各种营养成分(如葡萄糖、氨基酸、矿物质等),

经过血液运输到全身各个脏器和组织,同时将各个脏器和组织产生的各种代谢产物(如C02、尿素等),通过血液输送到肺、肾等排泄器官排出体外。
2.协调功能:将各种激素、酶类运输到相关组织器官,实现对全身各组织器官功能活动的协调。
3.维护机体内环境稳定:通过循环与身体各部位广泛沟通,对体内水电解质平衡、酸碱平衡、体温恒定有重要作用,使机体保持一个适宜而稳定的理化环境。
4.防御功能:白细胞、抗体、补体、细胞因子具有强大免疫功能。血小板、凝血因子具有止血和凝血作用。

第二节 采血方法


  血样本的正确采集是获得准确、可靠实验结果的关键。在样本采集前,应根据实验要求,决定采血方法、所需血量及适用抗凝剂。
  本节要点:
  (1)静脉采血法
  (2)皮肤采血法
  (3)真空采血法
  (4)方法学评价
  (5)质量控制
  (一)静脉采血法
1.概述:静脉采血多采用位于体表的浅静脉,通常采用肘部静脉、手背静脉、内踝静脉或股静脉。小儿可采颈外静脉血液。根据采血量可选用不同型号注射器,配备相应的针头。某些特殊检查,为避免血小板激活,要使用塑料注射器和硅化处理后的试管或塑料试管
2.操作方法和注意事项
  (1)患者准备:采血前应向患者耐心解释,以消除疑虑和恐惧心理。如个别患者进针时或采血后发生眩晕,应让其平卧休息。必要时可嗅吸芳香氨酊、针刺(或指压)人中和合谷等穴位。若因低血糖诱发眩晕,可立即静脉注射葡萄糖或让患者口服糖水。如有其他情况,应找医生共同处理。
  (2)检查注射器:静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固,针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光滑、通气,针筒不漏气。
  (3)消毒:先用30g/L碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤,待碘酊挥发后,再用75%乙醇棉签以同样方法拭去碘迹。
  (4)穿刺:以左手拇指固定静脉穿刺部位下端,右手拇指和中指持注射器针筒,食指固定针头下座,使针头斜面和针筒刻度向上,沿静脉走向使针头与皮肤成30°角斜行快速刺入皮肤,然后以5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。见回血后,将针头顺势探入少许,以免采血时针头滑出;但不可用力深刺,以免造成血肿,同时立即去掉压脉带。
  (5)抽血:针栓只能外抽,不能内推,以免静脉内注入空气形成气栓,造成严重后果。
  (6)放血与混匀:取下注射器针头,将血液沿试管壁缓缓注入抗凝管中,防止溶血和泡沫产生。
  (二)皮肤采血法
1.概述:曾被称为毛细血管采血法,是采集微动脉、微静脉和毛细血管的混合血,同时含细胞间质和细胞内液。通常,选择耳垂或手指部位。耳垂采血痛感较轻、操作方便,但血循环较差、受气温影响较大、检查结果不够恒定(如红细胞、白细胞、血红蛋白和血细胞比容等测定结果比手指血或静脉血高),一般情况下不宜使用。手指采血操作方便,检查结果比较恒定,世界卫生组织(WHO)推荐采集左手无名指指端内侧血液,婴幼儿可采集大拇趾或足跟内外侧缘血液,严重烧伤患者,可选择皮肤完整处采血
  目前可用激光无痛采指血仪采血,原理是仪器中激光发生器发出一串单脉冲激光束,在一次性耗材(镜

头片)的配合下,细微的光束打在手指上,在很短时间内使皮肤组织溶解、挥发,出现一个小孔,而打孔后的残留物成等离子状态,吸附在镜头片表面。仪器采血有效地避免了皮肤浅层组织液、细胞外液等渗入血液,确保检测结果准确,同时也可消除交叉感染,达到无痛采血的效果。
2.操作方法和注意事项
  (1)所选择采血部位的皮肤应完整,无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。除特殊情况外,不要耳垂采血。
  (2)本试验具有创伤性,必须严格按无菌技术操作,防止采血部位感染,做到一人一针一管,避免交叉感染,最好用一次性器材。
  (3)皮肤消毒后,应待75%乙醇挥发后采血,否则流出的血液扩散而不成滴。
  (4)采血时,先应按摩左手中指或无名指指端内侧,使局部组织自然充血。针刺深度2~3mm
  (5)因第1滴血混有组织液,应擦去。如血流不畅切勿用力挤压,以免造成组织液混入,影响结果的准确性。
  (6)进行多项检查时,采血的顺序依次为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血型鉴定等。
  (三)真空采血法
  又称为负压采血法。真空采血装置有套筒式、头皮静脉式两种。封闭式采血无需容器之间的转移,减少了溶血现象,能有效保护血液有形成分,保证待验样本原始性状的完整性,使检验结果更可靠,同时,样本转运方便,能有效避免医护人员和患者间交叉感染。各种真空定量采血容器,根据需要标有不同的色码,适于不同检验项目(表1-1-1)。

(四)方法学评价
1.皮肤采血:缺点是易于溶血、凝血、混入组织液,而且局部皮肤揉擦、针刺深度不一、个体皮肤厚度差异等都影响检查结果,所以,皮肤采血检查易发生凝块,结果重复性差、准确性不好。
2.静脉采血:开放式采血法的操作环节多、难于规范统一,在移液和丢弃注射器时可能造成血液污染。封闭式采血法的操作规范,有利于样本收集运送和保存,防止院内血源性传染病
  (五)质量控制
1.患者:患者活动情况、精神状态、药物、年龄、性别、种族、样本采集时间、吸烟、季节等都会影响检测结果。如正常人一日之间,白细胞数、嗜酸性粒细胞数、血小板数等均有一定的波动。
2.采血:采血前,患者应尽量减少运动保持平静。住院患者应在早晨卧床时取血。冬天,患者从室外进入室内,应等其暖和后再采血。止血带结扎时间超过2分钟,大静脉血流受阻而使毛细血管内压增高,血管内液与组织液交流,使分子质量<5000的物质逸入组织液,或缺氧引起血液成分的变化,使检查结果增高或减低
3.溶血:血细胞内、外各种成分有梯度差,有的成分相差数10倍(表1-1-2),故在采集、运输、保管、分离血细胞时应尽量避免溶血。因容器不洁、接触水、强力振荡、操作不慎等可引起溶血,使红细胞计数、血细胞比容、血浆或血清化学成分(如钾、镁、转氨酶、胆红素)等多项指标检验结果增高或减低,不能确切反映原始标本的实际含量。


4.样本处理:血液样本采集后应立即送检,并尽快进行检查,样本保存不当直接影响实验结果。血浆在4℃保存24h后,某些凝血因子活性减少95%。低温(4℃)保存血液可使血小板计数结果减低。因此,应根据实验项目确定最佳的保存条件。
5.结果分析:分析结果时,应考虑药物、饮食等因素对结果的影响。同时,应密切结合临床。如患者有严重腹泻或呕吐时,红细胞计数可因脱水而相对性增高。

第三节 抗凝剂选择 


  本节考点:
1.抗凝剂选择
  抗凝是用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性,以阻止血液凝固。能够阻止血液凝固的物质,称为抗凝剂或抗凝物质。

一、常用抗凝剂和使用方法如下
1.乙二胺四乙酸(EDTA)盐:常用有钠盐(EDTA-Na2·H20)或钾盐(EDTA-K2·2H2O),能与血液中钙离子结合成螯合物,使Ca2+失去凝血作用,阻止血液凝固。根据国际血液学标准化委员会(ICSH)建议,CBC抗凝剂用量为EDTA-K2·2H2O,量为1.5~2.2mg/ml血液。不适于凝血检查、血小板功能试验。
2.草酸盐:常用有草酸钠、草酸钾、草酸铵,溶解后解离的草酸根离子能与样本中钙离子形成草酸钙沉淀,使Ca2+失去凝血作用,阻止血液凝固。2mg草酸盐可抗凝1ml血液。但不适于凝血检查。而且,草酸盐浓度过高还会导致溶血、改变血液pH,干扰血浆钾、钠、氯和某些酶活性的测定。
  双草酸盐抗凝剂:适用于血细胞比容、CBC、网织红细胞计数等检查,不适于血小板计数、白细胞分类计数。
3.肝素:是加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶作用,阻止凝血酶的形成,并阻止血小板聚集等作用,从而阻止血液凝固。肝素是红细胞透渗脆性试验的理想抗凝剂。但不适于CBC、细胞形态学检查。每毫升血液肝素用量为(15±2.5)U,多为肝素钠盐或钾盐。
4.枸橼酸盐:常用有枸橼酸钠,能与血液中钙离子结合形成螯合物,阻止血液凝固。枸橼酸盐抗凝剂的抗凝力不如上述抗凝剂。枸橼酸钠与血液的抗凝比例为1:9或1:4。适用于红细胞沉降率、凝血检查,是输血保养液的成分

习题1.红细胞脆性试验的首选抗凝剂是
A.EDTA-K2
B.拘橼酸钠
C.草酸钠
D.肝素
E.双草酸盐

[答疑编号500725010201]






『正确答案』D


第四节 血涂片制备


  本节考点:
  (1)载玻片的清洁
  (2)血涂片的制备

一、玻片的清洁
  新载玻片常带有游离碱质,必须以1mol/L HCl浸泡,清洗。载玻片应清洁、干燥、中性、无油腻。

二、血涂片的制备
1.手工推片法:影响涂片厚薄的因素有:血滴大小、推片与载玻片间夹角(25°-30°)、推片速度、血细胞比容。一张良好的血片,应厚薄适宜、头体尾明显、细胞分布均匀、血膜边缘整齐、并留有一定空隙。
2.载玻片压拉法:适用于血细胞活体染色。
3.棕黄层涂片法:适用于白细胞减低患者的白细胞分类计数、红斑狼疮细胞检查等。

1 血涂片制备 

一般良好的涂片是:厚薄适宜,头体尾分明,细胞分布均匀,边缘整齐,两边和两端留有空隙各0.3cm和0.5cm,血膜占血片的2/3。

 

第五节 细胞染色 


  本节考点:
  (1)瑞氏染色法
  (2)吉姆萨染色法
  血涂片在用光学显微镜观察前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固,以保持细胞原有形态结构不发生变化。染色是使细胞的主要结构,如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色,以便于镜下观察识别。
  血涂片染色方法大多源自罗氏染色法,常用瑞氏染色法、姬姆萨染色法。

一、瑞氏染色法
1.瑞氏染料
  由酸性染料伊红(E-)和碱性染料亚甲蓝(M+)组成。伊红通常为钠盐,有色部分为阴离子。亚甲蓝(又名美蓝)为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐,即氯化美蓝,有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料(即天青)。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中,即为瑞氏染料。甲醇的作用:一是溶解美蓝和伊红;二是固定细胞形态
2.染色原理
  既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结合,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染紫蓝色或蓝色,称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染淡紫红色,称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质,染成较浓厚的蓝色;中幼红细胞既含酸性物质,又含碱性物质,染成红蓝色或灰红色;完全成熟红细胞,酸性物质彻底消失后,染成粉红色。
3.pH的影响 pH6.4~pH6.8)
  细胞各种成分均属蛋白质,因蛋白质系两性电解质,所带电荷随溶液pH而定,在偏酸性环境中正电荷增多,易与伊红结合,红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红,细胞核呈淡蓝色或不染色;在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝结合,所有细胞呈灰蓝色,颗粒呈深暗,嗜酸性颗粒呈暗褐,甚至棕黑色,中性颗粒偏粗,呈紫黑色。稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则可导致细胞染色呈色异常,形态难以识别,甚至错误。
4.染色方法和注意事项
  (1)血涂片干透后固定,否则细胞在染色过程中容易脱落。
  (2)冲洗时应以流水冲洗,不能先倒掉染液,以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久,以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积,可滴加甲醇,然后立即用流水冲洗。
  (3)染色过淡可以复染,复染时应先加缓冲液,然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡,也可用甲醇脱色。
  (4)瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇(AR级以上)和甘油组成,Ⅱ液为磷酸盐缓冲液(pH6.4~pH6.8)。


二、姬姆萨染色法
1.染色原理
  姬姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色基本相同。
2.染色方法和注意事项
①需先用甲醇固定3~5分钟。
②姬姆萨染液由姬姆萨染料、甘油和甲醇组成。染色前,用磷酸盐缓冲液(pH6.4~pH6.8)稀释姬姆萨染液10~20倍。
  习题2:以下哪项对瑞特染色效果影响最大( )。
A.染色液pH
B.染色前血涂片是否干燥
C.细胞数量
D.冲洗时是否先倒去染液再冲洗
E.染色时间和室温

[答疑编号500725010202]


『正确答案』A
『答案解析』染色液pH对细胞染色效果影响很大,由于细胞内许多成分为蛋白质,而蛋白质为两性电解质,所带电荷随溶液pH而定,在偏酸性环境中正电荷增多,易与染液中伊红(酸性染料)结合,染色偏红;在偏碱性环境中负电荷增多,易与染液中美蓝或天青(碱性染料)结合,染色偏蓝。因此,染液的pH应恒定在6.4-6.8之间。配制染液时必须使用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗染片必须用中性水。否则染色异常,形态难以识别。

  习题3:关于瑞特染色的叙述,下列那项是错误的( )。
A.甲醇的作用是溶解美蓝和伊红,固定细胞形态
B.是酸性染料美蓝和碱性染料伊红组成的复合染料
C.缓冲液的pH值对细胞着色有较大的影响
D.新鲜配制的染料需放置一段时间后才能使用
E.染色时间受室温的影响

[答疑编号500725010203]


『正确答案』B

  习题4:Wright染色后结果偏酸,可出现以下那种情况( )。
A.所有细胞染灰蓝色
B.嗜酸粒细胞、嗜酸性颗粒染成暗褐色
C.白细胞核呈浅蓝色或不着色
D.嗜中性颗粒染成紫黑色
E.淋巴细胞染成黑色

[答疑编号500725010204]


『正确答案』C
『答案解析』在偏酸环境中,红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红,细胞核呈淡蓝色或不染色;而在偏碱性环境中,所有细胞呈灰蓝色、颗粒呈深暗,嗜酸性颗粒呈暗褐,甚至棕黑色。中性颗粒偏粗,呈紫黑色。

第六节 方法学评价 


  本节考点:
  (1)血涂片制备
  (2)血液细胞染色

一、血涂片制备
  手工推片法用血量少、操作简单,是应用最广泛的方法。棕黄层涂片法可提高异常情况的阳性检出率。此外,疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血涂片法。离心涂片法,可获得分布均匀、形态完好的细胞涂片。

二、血液细胞染色
  瑞氏染色法是最经典、最常用染色法,尤其对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果,但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染液对细胞核、寄生虫(如疟原虫等)着色较好,结构更清晰,但对细胞质成分的着色能力略差。采用瑞氏-姬姆萨复合染液可使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
  瑞氏染料的质量规格用吸光度比值(rA)来评价,rA测定方法:取瑞氏染液15~25μl,加甲醇10ml稀释,混匀,以甲醇为空白管,分别在波长650nm(美蓝吸收峰波长)、525nm(伊红吸收峰波长)测定吸光度(rA=A650/A525)。新配制染料rA接近2,随美蓝逐渐氧化为天青B(其吸收峰为650nm,吸光度约为美蓝一半),rA也下降,降到1.3±0.1时,染料即可使用。新鲜配制的染料偏碱,须在室温或是37℃下贮存一定时间,待美蓝逐渐变为天青B,贮存时间愈久,染色效果愈好。在贮存过程中,必须加塞,以防甲醇挥发(如加甘油)和氧化成甲酸,所用甲醇须为AR级,若其中含过多丙酮,会使染色偏酸,白细胞着色不良。

第七节 质量控制 


  本节考点:
  (1)血涂片制备
  (2)血液细胞染色

一、血涂片制备
  制备涂片时,血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快,血膜愈厚,反之则愈薄。血细胞比容增高、血液粘度较高时,应采用小血滴、小角度、慢推,可得满意结果;血细胞比容减低、血液较稀时,应采用大血滴、大角度、快推。

二、血液细胞染色
染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH密切相关。过深纠正方法是缩短染色时间、稀释染液、调节pH,过浅纠正方法是延长染色时间、调节pH。


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