北京物流信息联盟

轻松七步掌控免疫荧光

解螺旋 2021-04-06 12:54:12

点击上面蓝字↑↑↑关注【解螺旋】


——日读一帖,解螺旋大V团队伴你科研路


作者:中子

解螺旋出品,转载需经授权 


 免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,它是标记免疫技术中发展最早的,在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,对抗原进行细胞定性和定位分析。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。自此该技术在科研领域发光发热啦!


  免疫荧光主要有如图两种检测方法:



  

  新手在开始免疫荧光实验的时候,经常被例如细胞铺板密度、细胞固定以及如何确保抗体特异性等问题困扰,以下是中子几年实验下来的一些小小建议,希望可以帮助小伙伴们获得更好的实验结果:


1、 对于细胞爬片的免疫荧光选择合适的细胞种板密度


  细胞数过多时,生长过密,细胞结构不清,易导致染色背景深,细胞数过少时,会使贴壁贴壁不佳,状态不好,一般以六孔板为例,(1-5)×100000比较适宜。


2、细胞更好地固定


  为达到最佳检测效果,细胞需要经过固定和通透,此步骤很重要,现在固定液选择比较多,有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液(1:1),但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。


3、优化封闭液


  为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致 如 一抗为兔抗,二抗为山羊抗兔,那么封闭液就用山羊血清)封闭,减弱背景着色。


  血清封闭的时间是可以调整的,一般为30min。


4、抗体的特异性,设立对照组


  这个关系到结果的准确性,一定要选择特异性强的抗体,这样可以避免高背景和不理想的蛋白定位,并且选择合适的抗体稀释比例,一般1:20-100 之间比较合适,但还是要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀释比例,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察噢!加入荧光抗体后一定要记得避光!!!每次试验时 ,建议设置以下三种对照:


① 阳性对照:阳性血清+荧光标记物

② 阴性对照:阴性血清+荧光标记物

③ 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物


5、洗涤也要重视


  为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,一般在一抗的清洗是5min*3次;


注意:

(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。

(2)温柔冲洗,防止切片的脱落;

(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。

(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求,建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)


6、复染和封片是最后收尾工作


  复染的目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位(一般常用DAPI复染)。而为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液(如博士德等公司);同时还要注意避免产生气泡。


7、见证“奇迹“的时刻——荧光显微镜下观察实验结果


  荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,一般标本在高压灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。



解螺旋每月为您精心准备一份科研资源包,包含以下内容

  • Cover letter 范例集;

  • 投稿须知细节标注示例;

  • SCI 投稿各阶段的电子邮件模板集合

  • 质粒图谱大全

  • 细胞信号通路图谱大全

  对上述资源包有兴趣的朋友请帮忙转发此文后向解螺旋.小编(微信号:helixlife9)索取,也可以二维码加好友。


长按二维码5秒,识别二维码即可加解螺旋小编为好友!




解螺旋.科研公益讲座系列.RNA-seq(上海)


  RNA-seq是一种定量分析转录组的高通量测序技术,相比于传统的芯片技术,精度更高,应用更广泛。可用于观察疾病发生过程中病灶部位内部的基因表达水平变化、预测肿瘤中潜在的融合基因、研究已知lncRNA的表达、预测新的lncRNA、进行新物种的转录组数据构建和功能研究等方面。


  在经历不到10年的发展历程后,RNA-seq技术已成为一种常规的高通量实验技术,并且已经成为转录组分析的主要工具。如此高大上的技术,其实你也可以拥有。5月14日就让我们在解螺旋两位大V专家的指引下,一起加入转录组研究的神秘旅程!


讲座内容包括:


  • 转录组研究历史和现状

  • 高通量测序原理

  • 转录组研究基本思路

  • 转录组数据的比对

  • 表达量估计和分析

  • 差异表达与功能分析


主讲人:

  解螺旋大V专家:黄老师、张老师,多年从事高通量测序数据分析与相关流程构建工作,在转录组、lncRNA和单细胞测序等方面积累了丰富的经验,工作成果已发表在 Cell、Cell StemCell、 BMC Genomics等杂志。


地点:上海师范大学桂林路64号1号楼107室

时间:2015年5月14日(周四)晚6点-8点


上海地区有兴趣参加的朋友请扫码入群报名




解螺旋科研系列培训课通知!


  • Meta分析培训班武汉站(2015/5/16-2015/5/17)


  • 课程介绍:本次培训内容围绕系统评价的制作流程进行设计,包括循证医学、系统评价/Meta分析概述;临床研究问题的构建;Meta分析中的统计学问题;循证医学文献检索策略与方法;常见的临床研究报告的质量评价;全面掌握干预性、诊断性、病因、预后等系统评价/Meta 分析的制作方法;掌握Revman5.3 软件Stata13.0软件等软件在Meta 分析中的应用,最终具备独立制作系统评价解决问题的能力。

  • 适合人群:本次培训课程为初中级META分析强化班课程,含两天一晚,适合希望学习META分析在生物医学上应用的广大临床科研工作者和医生,对于有一些基础和对META有兴趣但基础较差的学生也可以加速学习过程,给予整体学习的方向指引。


有兴趣的朋友请点击本文左下角“阅读原文”或咨询:

固话:021-64173538-800(工作日:8:30-17:00)

移 动 电 话:18082338338(申老师)

      13661429647(张老师)



解螺旋近期最受欢迎的文章

miRNA数据库大全(索引号:J013)

lncRNA的研究策略和技术方法(索引号:J020)

SCI写作常用精彩句式汇总(典藏版)(索引号:W038)

SCI修稿攻略——不能错过的tips!!!(索引号:W020)

META系列:10分钟学会亚组分析森林图(索引号:T010)

OMG!NCBI竟然能批量下载基因序列!(索引号T007)

2分钟学会简单粗暴的设计qPCR引物(索引号:E016)

图文并茂的教你做分子构建(典藏版)(索引号:E012)

【国自然专刊一】科学假设是基金的灵魂(索引号:G011)

【国自然专刊二】立项依据的框架性思维(索引号:G012

医生科研设计“五宗罪”(索引号:N010)

临床基础科研的“七品”格调(索引号:N003)

医院这么大,你想走哪儿去(索引号:F015)

当我们做科研时,经常被哪些歌词洗脑?(索引号:F016)

如需查看以上文章,请关注公众号:解螺旋(helixlife)后输入索引号查询,也可以按下图长按指纹识别二维码关注。

解螺旋

做或不做科研,从医之路大不同!解螺旋,一个帮临床医生提高科研能力,分享学术经验,争取行业话语权的平台!

微信号:HelixLife