本期小编给大家带来一篇文章分享，来自于科罗拉多大学丹佛分校 Angelo D'Alessandro 教授课题组 2017 年发表在 Rapid Communication in Mass Spectrometry 上的一篇文章，题为 A three-minute method for high-throughput quantitative metabolomics and quantitative tracing experiments of central carbon and nitrogen pathways。
在精准医学所依赖的大规模队列研究中，实验通量和数据重现性是最为重要的考量指标。Angelo D'Alessandro 教授课题组基于 Vanquish-Q Exactive 技术建立了 3 min 方法测定 400 多种代谢物的方法。
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该方法基于 Vanquish UHPLC 系统和 Q Exactive 超高分辨质谱，使用 Kinetex C18（2.1 mm x 150 mm,1.7µm）反向色谱柱，0.25 mL/min 流速下，柱温 25℃，乙腈：水 5:95-0.1% 甲酸体系下等度洗脱。Orbitrap 质谱采用 70,000 分辨率下一级全扫模式（60~900m/z）分别进行正离子及其负离子扫描。
作者从分离能力上着重考察了方法的选择性，对于糖酵解途径、三羧酸循环、谷氨酰胺异化、多胺代谢等主要代谢途径的化合物具有较好的分离能力，如图 1 所示：
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图 1：不同极性化合物分离色谱图
并对代谢物中的同分异构体可实现基线分离，如亮氨酸和异亮氨酸，延胡索酸和马来酸，柠檬酸和异柠檬酸，下图是 2,3-cAMP 和 3,5-cAMP 提取一级色谱图分离情况如图 2：
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图 2：2,3-cAMP 和 3,5-cAMP 提取离子流图
在所建立的方法条件下，作者使用复杂基质样品考察方法重复性。6 天连续运行 1200 个样品测试，每隔 15 次进样穿插 QC 样品考察方法保留时间、峰面积、质量精确度重复性，以谷胱甘肽为例重复性如图 3 所示：
1）峰面积变异系数为 2.7%；
2）保留时间变异系数为 0.28%；
3）精确质量数均保持在 5ppm 内；
4）13C1 同位素峰 M+1 相对强度平均偏差小于 0.5%：
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图 3：谷胱甘肽峰面积、质量精确度、同位素峰相对强度重复性测试
基于所建立方法，考察了外标法及其同位素内标法线性范围及其定量准确性：
1）外标法定量：作者测试了碳途径和氮途径中的重点代谢物线性相关系数及其灵敏度，线性相关系数均大于 0.98，线性范围均达四个数量级，检出限在 100 fmol；
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图 4：代谢物线性关系
2）内标法定量：作者以同位素内标 13C5-Glucose 加入到复杂基质中定量样品中 Glucose 的含量，在线性范围 0.1~1000µmol,13C5-Glucose 线性相关系数大于 0.998，不同天测定线性方程接近；
3）离子抑制效应考察：作者对加入内标的基质样品进行 1 倍稀释，分别定量稀释前后样品中 Glucose 浓度，定量浓度和稀释倍数对等，并对其他代谢物采用同样方式进行离子抑制效应考察，结果如图 5 所示。
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图 5：内标法定量结果
UHPLC-MS 方法应用于创伤性型小鼠与代谢物关系分析
作者通过对创伤性小鼠的淋巴液、支气管肺泡灌洗液、血浆的研究，发现创伤性小鼠体液中琥珀酸具有明显的差异性。
为了验证琥珀酸的来源，作者对小鼠创伤性和正常小鼠同时进行 13C515N2-glutamine 静脉注射，基于建立的 UHPLC-MS 方法追踪受伤小鼠和正常小鼠肺中具有同位素标记的琥珀酸含量，如图 6 所示，发现同位素标记代谢物谷氨酰胺、琥珀酸具有在创伤性小鼠体内具有明显的上调趋势。
这应该是谷氨酰胺通过谷氨酰胺分解途径产生的谷氨酰胺进入 TCA 代谢途径，促进琥珀酸的积聚，验证了作者提出的受伤小鼠会促进琥珀酸累计，谷氨酰胺代谢途径中的一些酶可能对于小鼠因创伤性休克起着重要的修复作用的假设。
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图 6：创伤性小鼠肺中代谢物研究
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图 7：谷氨酰胺分解
本文基于 Vanquish UHPLC 和超高分辨质谱 Q Exactive 系统，建立了在 3 min 时间内适用于不同复杂基质中 400 多种代谢物测定高通量方法，可准确测定糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、鸟氨酸循环、氨基酸代谢途径、嘌呤代谢及其嘧啶代谢等重要代谢途径中代谢物，具有较好的保留时间、质量精确度、峰面积重复性及其稳定性，且适用于血浆、体液、微生物、组织等多种复杂基质。
与常规方法相比，大大提高了代谢物测定通量，有效助力精准医学、转化医学及其临床研究对于高通量的需求。
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作者：赛默飞
图片来源：赛默飞
题图来源：shutterstock.com 正版图库
