Alere q HIV检测芯片内部结构和检测流程

2022-02-14 11:17:48

Alere q HIV-1/2芯片内部结构和检测流程

1 Alere q HIV 1/2检测平台简介

Alere公司的q HIV，其主要优势为：采用多重且实时PCR技术来进行分子诊断，小型轻便的POCT仪器可以保证检测在野外，战地等非中心实验室条件下进行，检测速度快，可以在52分之内得出准确的检测结果，所需血样少，只需25uL末梢血，特别适合于在医疗资源有限地区对婴儿和母亲进行HIV检测。

对婴儿进行早期HIV筛查是非常有必要的，有研究表面，HIV阳性母亲的婴儿中有72%没有在早期进行HIV检测，在340万HIV阳性儿童中有66%没有进行任何治疗，这一数据在贫穷的非洲地区尤其明显。如果没有进行及时的HIV检测和抗逆转录病毒治疗（ART），约三分之一的儿童会在一周岁前死亡，2岁前死亡。

图1.1 HIV会通过母体传染给婴儿，并在婴儿体内变异。

但是，对婴儿进行早期HIV检测确实非常困难的，对于成人所采用的普遍性抗原抗体检测难以准确诊断婴儿是否患有HIV，因为难以确定婴儿体内的HIV抗体是其自身产生的还是来自于HIV阳性母亲。

Alere q HIV检测平台却可以对8-12周内的婴儿进行检测，通过基于核酸扩增法来检测婴儿是否是HIV感染者，这是该检测平台的主要优势。下图是Alere q HIV检测仪器的外观结构图。

图1.2 Alere q HIV检测仪器外观结构图

Alereq检测仪器的外观结构各部分功能说明如下图所示，主要功能部件有触摸屏，电源开关，电源指示灯，充电状态指示灯，芯片加载窗口等。

图1.3 Alere q HIV检测仪器正面图

图1.4 Alere q HIV检测仪器背面图

如下为Alere qHIV-1/2检测芯片的外观结构图。

图1.5 Alere q HIV-1/2检测芯片外观结构图。

2 检测芯片的内部结构

从外面来看，Alere qHIV-1/2检测芯片的结构大体上如下图所示，包含有采样毛细管1，通气孔2，中心孔3，储液池4，样品指示口5，盖子6。从名称上就能知道各结构的功能。

从结构上来讲，芯片左边的黑色部分起到固体支撑作用，同时该左边部分的一个表面为坚固材质，而另外一个表面为柔性材质，这种结构安排可以允许仪器通过特殊的结构来驱动芯片内部液体运转。右边部分为光学透明材质.

图2.1 芯片内部结构的大体部位。

下图更加详细地展示该检测芯片的内部结构，其中有些流体连接微通道位于背面，在该视图中不可见。在这个内部结构中各部分名称和功能可以归纳为：

1，盖子：用于样品加载后密封芯片，维持芯片内部气压，并且防止血样外漏污染环境。

2，毛细管：采集血样用，内含EDTA等抗凝剂，在其下端有透明窗口，用于仪器读取并辨认样品已经加入，这是该芯片的一个质控机制。

3，裂解池：内含冻干的裂解试剂，IPC内部质控物，冻干的捕获探针试剂。此处为血液和HIV病毒发生裂解的地方，也是HIV RNA和捕获探针结合的场所，该捕获探针是一段特异性RNA结合片段，其3`端标记有生物素素基团。

4，清洗液池：内部存储有冻干的清洗液试剂，但对结合后颗粒的清洗过程却不是在该结构处，该结构只是试剂储存部位。

5，PCR试剂池：RT-PCR反应所需的试剂均以冻干粉的形式存储在该结构处，在液体进入后会复溶该部分试剂。

6，中心孔，发生NAAT核酸扩增反应和检测的部位，也是捕获探针-RNA复合物与第一结合元件结合的部位，同时也是报告分子与靶核酸结合，且剩余报告分子与第二结合元件结合的地方，也是光学检测的部位，这是个非常重要的部位，位于芯片的最前端，直接对应于仪器中的温控模块内和光检测模块内。

7，其他部位：通气孔：用于仪器给芯片提供气压，促使内部流体运转。阀门：流体网络中的开关，使得流体按照预想的方式进行流转。储液池：内部存储液体状的缓冲液或水，用于溶解芯片上部位的冻干试剂。

8，气压弹簧池：位于最右上角，当向中心孔中压入液体时会挤压该部位使得内部气体压缩，不压入液体时，会将中心孔内的液体压入废液池，以此方式来完成清洗过程。

图2.2 Alere q HIV-1/2检测芯片内部结构图。

虽然上面列出了各部位的名称和功能，但芯片上没有指出具体的微流体网络，下图是Clondiag公司（该公司在2006年被Alere收购，故而本检测仪器和芯片也归于Alere所有）的专利WO2008055915，US20150197822，CN201510970493中公开的本检测芯片内部微流体网络图。该图和上面的图的区别在于储液池放置在了芯片上方。

在该图中流体的运作方式是，在下方流体连接口阀门关闭的情况下，血样通过毛细管被吸入到裂解室内，并在此处发生细胞裂解，同时HIV-RNA与捕获探针结合，复合物液体被气压推入到中心孔内，挤压中心孔上部的气压弹簧，该气压时仪器通过芯片上方的气压接口提供的，复合物液体进入中心孔后，会溶解中心孔内部的第一结合元件（即链霉亲和素-琼脂糖粒子），在温育一段时间后，复合物上的捕获探针末端的生物素会结合到该第一结合元件上，组成第一结合体。

通过致动器将储液池中的缓冲液推入一部分到第一清洗液室中，溶解该处的清洗液冻干粉剂，在气压的作用下，将该部分清洗液推入到中心孔中，对位于中心孔内部的第一结合体进行清洗，清洗完成后，停止提供气压，让气压弹簧内部的压缩气体方向挤压中心孔，使得中心内部的清洗液反向进入废液室。同样的方式进行第二次清洗，将未结合到结合元件上的杂质清洗干净。在通过同样的方式将PCR反应试剂进行复溶并转移到中心孔，在此处发生qRT-PCR，并进行光学检测。

图2.3 Alere q HIV-1/2检测芯片内部微流体网络图。

为了达到上述流体运转和HIV检测的目的，需要芯片内部各部分结构的配合，下图是该芯片上表面结构图，虽然和实际产品有些差别，但其基本结构却是类似的，图中可以看到有裂解液室，清洗液室，PCR储液室等等结构。

图2.4检测芯片结构的正面图。

下图是该检测芯片的反面图，图中主要结构为流体微通道，用于连接各部位之间的流体，使其能按照上图所示的微流体网络来运转。

图2.5检测芯片结构的反面图。

正面和反面图单独来看，难以看出其中的流体网络结构，也对该芯片的工作模式不甚理解，幸好该公司的专利中还公开了这两个部分结合起来的结构图，如下所示。从这个图中可以大概看出该芯片上流体的运作模式。这个图中的流体网络与实际产品相比减少了下方的液体储液池，而是以水压接口等来表示。

图2.6 检测芯片结构的流体网络图。

虽然检测芯片的结构已经阐述明白，但是芯片在放入仪器后是如何与仪器进行交互作用，从而使得芯片内部的液体发生运转？下图解释了测试仪器内部的大体结构和仪器作用在芯片上的原理图。

仪器中的主要结构为气压控制系统，包括压缩机，压缩气体存储器，气阀单元，气动致动器等，这些部件的主要作用是在气压的作用下促使气动致动器发生推动，从而挤压芯片上面结构，促使芯片内部的腔室或阀门关闭和打开，进而控制流体的流向。同时该气压控制系统还有个气压接口连接到芯片上，促使芯片内液体在气压的作用下发生运转。感兴趣的朋友可以通过该公司的专利进一步深入了解仪器内部结构。

2.7 仪器通过气动致动器来控制和操作芯片内部液体流动。

3 Alere q HIV 1/2芯片的检测流程

任何一个芯片的检测归根结底都是生化试剂之间的反应，而芯片的作用是将这些复杂的生化反应集成在一个小范围内部实行，仪器的作用却是完全为芯片服务，促使芯片实现按步骤按体积进行生化反应。Alere q HIV检测芯片也不例外，所以我们有必要先了解下该检测芯片内部的试剂种类和组分，在前面部分中我们知道，该检测芯片中包含有干粉试剂和液体试剂，各部分试剂的具体组分如下表所示。各位专业技术人员应该可以从这些试剂组分就可以看出每种试剂的具体作用，此处不再赘述。

图3.1 Alere q HIV检测芯片内部各试剂组分和形态。

据Alere官网介绍，Alere q检测平台采用多重实时PCR方法来进行HIV检测，可以同时检测多个目标分子，即该检测平台可以区分并同时检测HIV-1（M/N）亚型，HIV-1（O）亚型和HIV-2型病毒。检测步骤也很简单，对于用户而言，只需采血-盖上盖子-插入仪器这三个步骤就可以，如下所示。

图3.2 Alere q HIV芯片检测时用户操作步骤。

所以用户需要做的就是，通过检测芯片上的毛细管从指间或脚跟取25uL末梢血，然后盖上盖子，防止血样从芯片中泄漏造成污染。最后将芯片插入到Alere q检测仪器中，并启动整个检测过程。

将检测芯片插入到仪器后，仪器内部的金属抓手会锁住芯片，防止检测过程中芯片位置变动，同时仪器内部的传感器会检测到芯片的存在，并启动芯片测试，其内部流程大体上如下图所示：

图3.3 Alere q HIV芯片内部检测流程图。

具体而言，这些检测流程可以分为：

A，RNA释放：使用离液盐（chaotropic salts，能破坏生物大分子三维结构的化学物质）完全破坏待检样品，使其细胞破裂并释放出所有核酸，包括结合细胞的HIV的RNA和血浆中HIV颗粒的RNA。

B，探针捕获：特异性捕获探针（特异性寡核苷酸）与HIV-1和HIV-2基因组序列进行互补性杂交，这些捕获探针在其3`-端偶联有生物素基团。

C，与结合元件结合：通过链霉亲和素-琼脂糖颗粒来捕获上述特异性捕获探针，故而被捕获探针结合的HIV RNA也被琼脂糖颗粒所捕获。（链霉亲和素有一个糖链侧链，很容易与多糖发生非特异性亲和作用）。

D，清洗：对琼脂糖颗粒进行清洗，去除非特异性结合的污染物，比如人类自身的核酸，细胞内蛋白质，细胞膜碎片等。

E，qRT-PCR：清洗完成后的琼脂糖颗粒上的HIVRNA进行反转录为HIV DNA，然后进行PCR反应。整个PCR过程进行45个循环。为了能够检测多个特定核酸序列，采用多重PCR方式，待检目标核酸为HIV-1M/N亚型，HIV-1 O亚型，HIV-2亚型等，故分别用不同的探针来扩增。

F：竞争性报告子检测法：PCR扩增产物的检测是基于竞争性报告子检测扩增法（CMA）来进行的，其使用固定核苷酸探针阵列作为第二结合元件，能够与溶液中的荧光标记报告子结合。为了使得起始信号强度最大化，反应所使用的报告子在5`和3`端均有荧光标记。在合适的条件下，报告子会特异性和固定化探针杂交，报告子也会与PCR产生的靶核酸扩增子特异性杂交，故而目标靶核酸会与固定化探针竞争性地结合报告子。在扩增反应开始时，几乎没有靶核酸，故而报告子几乎都是与固定探针阵列结合。但随着扩增反应的进行，在目标模板的存在下，会合成越来越多的带有报告子特异性结合位点的扩增子。随着扩增子的增加，杂交动力学越来越依赖于扩增子的浓度，合成的扩增子越多，就会有越多的报告子结合到扩增子上。除此之外，寡核苷酸探针所固定的固相载体会引入扩散屏障，该屏障可以极大的减少杂交速率，所以液相动力学反应会倾向于成为固相反应，因此，杂交到固定化探针上面的扩增子的数量会随着新形成的扩增子的数量增加而减少，该减少过程被监测直到扩增反应达到饱和期。可以通过在扩增过程中对阵列上的荧光强度进行成像来检测每个探针的信号强度的改变量。

G：结果分析：在获得杂交图像之后，使用一种算法来鉴别和消除不同的噪声信号，从而获取阵列辅助性实时PCR的数据，算法会通过这些扩增动力学数据来确定被分析物是否存在。

如下图简单解释了这一检测流程，并标识出每个阶段所处的状态。

图3.4 Alere q HIV芯片内部检测流程图。

4 Alere q HIV 1/2芯片的质控机制

除了传统的检测样本血浆之外，Alere q检测平台还可以检测全血，使用全血的一个好处在于HIV颗粒会吸附到各种各样血细胞，比如血小板，CD4-/CD8- T细胞，红细胞等，同时，细胞内HIV RNA会在外周血中的淋巴细胞中产生，使用全血作为检测样品可以检测到这些细胞结合的HIV颗粒，进而提高HIV感染的检出率，不仅如此，Alere q检测芯片还具有一套完整的成熟的质控机制，正是这套质控机制的存在，才确保了芯片检测结果的准确性和可重复性。

具体而言，Alere q检测芯片主要采用三种质控机制来确保检测过程顺利进行并得到准确的检测结果。

A，二维码控制机制：芯片表面的标签上有二维码信息，该二维码中包含有芯片种类，批号，有效期，患者ID等信息，当芯片插入到机器后，机器会自动读取二维码中的信息，进行一一检查后才开始芯片检测。

B，样品检测控制：单次检测所需的样品量是通过采样毛细管的尺寸来控制的，额定的所需样品体积是25（±2）uL，检测芯片上有样品指示窗口，用于指示用户待检样品是否足量，同时机器也会对该部位进行检测，确保每次检测的血样足够，对于红色的全血可以直接光学检测，但是对于血浆样品，其采样毛细管内表面还涂覆有一层染料（见试剂列表），采样后染料会和样品混合进而被仪器检测。

C，检测过程质控：每一个检测芯片内部都集成了过程质控机制，确保该芯片功能正常，这些质控主要分为三部分：内部过程质控（IPC），阳性杂交质控，阴性杂交质控。

C-1：对于HIV-1和HIV-2，其内部过程质控（IPC）被预装到芯片中的裂解池中（分别对应HIV-1和HIV-2的IPC质控，其本质均为一段人工病毒RNA片段），这些IPC和患者样品一样也会经历所有的处理步骤，可以检测到样品裂解，RNA分离，捕获，PCR和检测过程中可能出现的失误。这些IPC质控的序列被设计成可以和相同的捕获探针的序列杂交，但其固定微阵列上的探针和报告子不同，故而可以在检测时区分开来。