10月4日，在瑞典斯德哥尔摩，获得2017年诺贝尔化学奖的瑞士科学家雅克·杜博歇、美国科学家约阿希姆·弗兰克以及英国科学家理查德·亨德森（从左至右）的照片显示在屏幕上。 摄）

用物理学家的才思推动生物化学革命——记2017年诺贝尔化学奖获得者

　　见人所未见的世界，一直是科学探索的一个目标。但如何去见呢？理论在先，还是工具改进在先？

　　比如量子理论，是典型的概念带来实践和认知革命，而工具改进是否也会带来类似革命？2017年诺贝尔化学奖对这一问题做了一个交待。

　　英国科学家理查德·亨德森、美国科学家约阿希姆·弗兰克以及瑞士科学家雅克·杜博歇因为在冷冻显微术领域的贡献而获诺奖。

　　消息宣布后，不少科学界人士善意地调侃说，三个搞物理工作的“工匠”得了个化学奖。科学界利用三人不断改进的技术，得以高分辨率测定溶液中的生物分子结构，而又不破坏其形态，这一突破对生物化学产生了革命性影响。

　　正如化学奖评选委员会成员彼得·布热津斯基所说，今年的化学奖是跨学科研究的一个典型，技术在科学发现中正发挥越来越重要的作用。

　　“电镜鼻祖”——亨德森

　　“我一直觉得如果你做一些有趣的事情并且把它做好了，那么在某个阶段你就会因为做你喜欢的事情而获得很好的回报。”英国剑桥大学的分子生物学家亨德森几年前的预言今天应验了。

　　亨德森生于1945年，作为电子显微镜领域的开创者之一，他也是个生物物理学家，以一个物理学家的特有眼光看待生物化学领域，或许总能获得别样的思路。“我把从事的研究当成了一项吸引人的爱好，因为从来不会重复，总有新东西。”

　　把研究当爱好，就仿佛孩子爱玩并好奇周围一切一样，让亨德森在上世纪90年代才思泉涌，改进了传统电子显微镜，取得了原子级分辨率的图像。人们因此得以看到极其微观层面的世界。

　　研究不是亨德森唯一的爱好，他日常喜欢遛狗、划皮划艇、喝点葡萄酒，与孙子一起踢足球，还一直是个电影迷。

　　“我很幸运获得了这么好的教育，同时又有时间去从事其他活动。”亨德森说，他和几个朋友经常花很多时间在一起收集并维修一些老爷车，他们曾开着一辆1948年的老爷车游遍了苏格兰。

　　“跨界奇才”——弗兰克

　　77岁的德裔美国科学家弗兰克如今是哥伦比亚大学生命科学系教授。他的主要贡献是在上世纪70、80年代开发了一种图像合成算法，能将电子显微镜模糊的二维图像合成清晰的三维图像。

　　弗兰克物理学背景深厚，说他是物理学家也不为过。在德国的大学里，他研究的是熔点下的金的电子衍射，读博士时，接触了X射线晶体学，并师从德国著名的电子显微学家霍佩博士，并由此接触到了电子显微镜。

　　1970年弗兰克在德国慕尼黑理工大学获得博士学位后，获得了资助前往美国最好的几个实验室游学两年，其中包括美国航天局的喷气推进实验室。而在喷气推进实验室工作期间，他选择去学习图像处理技术。当时的他，怎么也不会想到他的这些功课日后会与化学有关联。

　　此后，弗兰克在英国剑桥大学从事电子光学研究。几年后又定居美国，从事一些与电子显微镜相关的公共卫生研究。丰富的“跨界”学术经历对他的成长很有帮助。

　　弗兰克发展了一系列成像算法并编写软件，实现无需结晶的蛋白质三维结构解析技术。尤其在核糖体三维重构方面有一系列的重要开创性工作，可惜当年解析核糖体结构而获诺贝尔奖的科学家不包括他。现在他在冷冻显微术领域获诺贝尔奖，实至名归。

　　“科学哲人”——杜博歇

　　如果说，亨德森和弗兰克在基本理论实践和重构算法方面有贡献，75岁的瑞士洛桑大学荣誉教授雅克·杜博歇则在样本制作方面有开创性贡献。

　　上世纪80年代，杜博歇发明了迅速将液体水冷冻成玻璃态以使生物分子保持自然形态的技术。通俗地说，生物细胞内的水一旦冷冻就会结冰，而这些冰晶会破坏细胞内各种物质的原有形态。让这些水变成玻璃态，就能让细胞内的各种分子保持原样，供电子显微镜观察。

　　杜博歇做出开创新研究之后，随着冷台技术的开发，低温冷冻电子显微技术才正式推广开来。2015年，这一成果已被同行认为是“诺奖级”。

　　杜博歇不仅是一位科学家，还堪称“哲人”。退休后，他在博客上经常写一些富有哲思的短文。他还广泛关注社会问题，提倡科学家要有社会责任感，成为“公民科学家”。他在一篇题为《教科学家成为公民》的文章中写道：“成为一名好科学家很难，成为一个好公民更难”，“成为一名好的公民生物学家需要一点哲学和历史，加上一些经济学和法律知识”。

诺贝尔化学奖官方解读：

原子层面看清生命的本质

　　北京时间10月4日消息，据国外媒体报道，诺贝尔化学奖刚刚揭晓！2017年诺贝尔化学奖授予雅克·杜邦内特（Jacques Dubochet），约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他们“在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电镜技术方面的贡献”。

　　他们在原子层面看清了生命的本质

　　2017年的诺贝尔化学奖授予雅克·杜邦内特（Jacques Dubochet），约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他们“在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电镜技术方面的贡献”。这是一种呈现生物分子三维立体图像的技术方法。使用冷冻电镜技术，研究人员能够将运动中的生物分子进行冷冻，并在原子层面上进行高分辨率成像。这项技术将生物化学带入了一个崭新时代。

　　图一：过去几年间，科学家陆续发布了多种复杂蛋白质复合体的原子结构。a。 一种控制昼夜节律的蛋白质复合体。b。 一种可感知耳中压力变化、使我们听到声音的感应器。c。 寨卡病毒。

　　在过去的数年间，大量令人惊叹的分子结构充斥着各类文献（如图一）：沙门氏菌用于侵袭细胞的注射端；导致化疗以及抗生素失效的蛋白质结构图；以及掌管生物昼夜节律的复杂分子结构等等。这里所展示的还只不过是冷冻电镜技术（cryo-EM）应用领域内很少的案例。当研究人员开始怀疑寨卡病毒和发生在巴西境内导致大量新生儿出现大脑损伤的“小头症”有关联时，他们利用冷冻电镜技术对病毒进行了直接成像。在短短数月内，原子层面分辨率的寨卡病毒的立体三维图像便产生出来了，科学家们基于这些成果迅速研发相应药物。

　　雅克·杜邦内特、约阿希姆·弗兰克以及理查德·亨德森的突破性贡献让冷冻电镜技术得以成为现实。这项技术将生物化学技术带入了一个崭新的时代，让科学家们获取高分辨率生物分子图像变得前所未有的容易。

　　图像是知识的载体和基础。在20世纪上半叶，生物分子——比如说蛋白质，DNA以及RNA都是生物化学地图上无法填充的空白区。科学家们知道这些物质在细胞内扮演着关键性作用，但我们无从知晓这些物质本身究竟是什么样的结构。直到1950年代，当英国剑桥大学的科学家们开始探索利用X射线研究蛋白质晶体结构时，这一问题才开始崭露曙光——这是历史上第一次，人类开始有可能将这些物质繁复缠绕的复杂结构用可视化的方式呈现出来。

　　到了上世纪1980年代，X射线晶体学成像方法得到了核磁共振（NMR）技术的帮助，用于研究固体状态或者溶液中的蛋白质结构。这项技术不仅揭示蛋白质的结构，还能研究蛋白质的运动及其与其他分子之间的相互作用。正是因为有了这两种技术的帮助，我们现在才会有囊括了数以千计生物分子模型的数据库可以使用，这些数据库现在被应用在从基础研究到制药公司的各行各业。

　　然而，这两种技术都有着基础性缺陷。对溶液内样品使用核磁共振技术对样品本身有限制，它只能应用于相对较小的蛋白质。而X射线晶体学方法要求必须首先将样品制作为晶体，比如进行低温冻结。即便如此，最终拍摄出来的图像看上去的效果仍然就像早期相机拍出的黑白照片，科学家们很难从这些模糊不清的图像中提取到关于蛋白质动态下的有价值信息。

　　另外，很多分子是很难制备成晶体样本的，这一缺陷最终让理查德·亨德森在1970年代下决心放弃X射线晶体学方法——而这，正是今年诺贝尔化学奖获奖成果故事的开端。

　　亨德森另辟蹊径

　　理查德·亨德森在英国剑桥大学获得X射线晶体学领域的博士学位。他利用这种方法对蛋白质进行成像，但是当他尝试对一种自然地内嵌于细胞膜上的蛋白质进行晶体制备时，却遭遇到巨大困难。膜蛋白难以操控。它们一旦离开原有的自然环境，也就是细胞膜之后就会萎缩成一团毫无用处的物质。

　　理查德·亨德森尝试成像的第一种膜蛋白难以制备足够用量的样本，而第二种膜蛋白则难以结晶。在经过数年的徒劳沮丧之后，亨德森开始尝试他最后的一种“杀手锏”——电子显微镜。在当时，电子显微镜是否真的能够在这一领域使用仍然是一个有争议的话题。这项技术被称为透射电镜，其原理或多或少与传统的显微镜类似，不同的只是会有一束电子束流射向样品，而不是传统显微镜那样是一束光线。

　　电子的波长远小于光子，因此电子显微镜能够分辨非常微小的结构——甚至是单个的原子。理论上讲，电子显微镜的分辨率要满足亨德森拍摄膜蛋白结构的需求是绰绰有余的，但是在现实中，这一目标却几乎是无法实现的。

　　当电子显微镜在1930年代被最早发明出来时，科学家们认为其只适合对“死的”物质进行研究。获得高分辨率图像所需的强烈电子束流会破坏生物材料样品，而如果降低电子束流强度，成像质量则会大幅下降。

　　除此之外，电子显微镜需要用到真空腔，而这也不适合应用于生物分子，因为在这样的环境下生物分子周围的水会迅速挥发掉。而当生物分子干涸时，它们的结构将崩塌，丧失自然结构特征，从而让成像结果变得毫无意义。所有这一切几乎都在告诉亨德森，他的大胆尝试注定将要失败。但是，他的尝试却由于他当时选中进行研究的蛋白质类型比较特殊而出现了转机，他研究的对象是细菌视紫红质。

　　这样还不够好

　　细菌视紫红质是一种内嵌在光合作用有机体细胞膜上的紫色蛋白质，其能够捕捉太阳光线中的能量。亨德森不再试图像以前那样将其从细胞膜上剥离，而是将其直接连同其所在的细胞膜一起放置到电子显微镜下进行观察。由于该蛋白质此时仍然处于细胞膜上的自然环境下，它继续保持着自己的自然立体结构。亨德森小组用葡萄糖溶液覆盖样本表面以防止其在真空腔内干涸。

　　但是强大的电子束流是一个问题，不过研究组从这种蛋白质在细胞膜上内嵌方式中获得了启发。他们没有采用高强度电子束流，而是使用了强度更低的束流。这样得到的图像对比度很差，无法分辨单个分子，但研究组利用了一个此前已知的事实，那就是这种蛋白质在细胞膜上是规整排列且朝向一致的。当所有蛋白质都发生同向衍射时，基于衍射模式计算，研究组能够反推得到更加精细的图像——这种方法与在X射线晶体学成像技术中使用的数学方法是类似的。

图二：图为1975年发布的首个细菌视紫红质粗略模型。图源《自然》第257期28至32页。

　　下一步，研究组将细胞膜样品再次放置到电子显微镜下，从很多不同的角度进行拍摄。通过这种方法，到1975年时他们已经能够得到细菌视紫红质的三维立体结构图像了（图2）。从图像中可以清晰观察到蛋白质链条是如何在细胞膜上来回穿行的。这是历史上使用电子显微镜获得的最佳蛋白质图像。很多人对这样的高分辨率图像印象深刻（其图像分辨率达到了7埃水平，相当于0.0000007毫米）。这是一个惊人的成就，但在亨德森看来，这样的结果还不够好。他的目标是达到X射线晶体学成像方法通常能够达到的分辨率水平——大约3埃左右，并且他坚信利用电子显微镜成像技术，这个目标是可以实现的。

　　第一张原子层面分辨率图像

　　在接下来的数年间，电子显微镜技术逐渐完善。镜片质量得到了改善，低温冷冻技术也有了新的进步。在进行观察之前，先利用液氮对样本进行快速冷冻，从而避免其受到电子束流的损伤。得益于这些技术进步，理查德·亨德森逐渐为他研究的细菌视紫红质蛋白图像加入更多细节。为了获得最佳分辨率，亨德森遍访世界各地最好的电子显微镜设备。最终，到了1990年，在他发表第一份细菌视紫红质立体模型整整15年后，亨德森达成了自己当年许下的目标：他对外发布了分辨率达到原子层面的细菌视紫红质立体图像（图三）。

图三：1990年，亨德森发布了原子级分辨率的细菌视紫红质结构。

　　通过这些工作，亨德森证明了，利用冷冻电镜技术是可以拍摄出分辨率媲美X射线晶体学传统方法的图像的。这是一项重要的里程碑。然而，这一成功有一个前提，那就是他选择的蛋白质很特殊，细菌视紫红质是有规则地内嵌在细胞膜上的。但是其他蛋白质却并非如此。

　　这个问题很重要，因为它决定了这种方法是否具有普适性，是否能够被推广应用：科学家们有可能利用电子显微镜获得那些分布上没有规律的蛋白质的三维立体结构图像吗？亨德森坚信这个问题的答案是肯定的，而他的同行们认为亨德森的想法太过乐观了。

　　与此同时，在大西洋的彼岸，纽约州卫生署，约阿希姆·弗兰克也一直在思考着同样的问题。在1975年，他发展出一种理论方法，能够将电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析和叠加处理，最终得到更高分辨率的三维立体图像。但弗兰克最终花费了超过10年时间才逐渐将这一方法一步步完善。

　　弗兰克的图像分析算法

图四：弗兰克生成三维结构的图像分析法

　　约阿希姆·弗兰克的方法（图四）基本原理是让计算机去自动分析电子显微镜获得的模糊二维图像，识别其中的蛋白质与周遭背景。他开发出一套数学方法，能够让计算机识别在图像中反复出现的模式。随后计算机将相类似的图像模式归类到一起并将这些图像中的信息进行合并叠加，从而生成更加清晰的图像。

　　通过这种方法，弗兰克获得了一系列高分辨率的二维图像。这些图像展示的是同一种蛋白质，但是角度不同。整套算法软件到1981年终于完成。下一步，弗兰克必须弄清楚这些不同角度的二维图像之间是如何相互关联的，基于这些信息，他要尝试将这些二维图像合并并构建三维立体图像。弗兰克在1980年代中期对外发布了部分他开发的图像算法，并基于这一算法发布了核糖体的表面结构模型，这是一种在细胞内的细胞器，主要功能是合成蛋白质。

　　约阿希姆·弗兰克的图像处理方法对于冷冻电镜技术的发展是基础性的。

　　现在，让我们把时间再回溯到1978年，此时的弗兰克正忙于完善他的图像处理算法软件，而就在这一年，今年诺贝尔化学奖的第三位获奖人雅克·杜邦内特被设在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室录用了。杜邦内特将要解决的是电子显微镜领域的另外一个基础性问题：当被放置于真空腔内时，生物样本是如何干涸并遭到破坏的？

　　杜邦内特的玻璃化方法

1984年杜邦内特首次通过玻璃水方法拍摄到样本周围的病毒。

　　在1975年，亨德森使用葡萄糖来保护样品，防止他的细胞膜样品干涸。但这种方法不适用于水溶性的生物分子。其他研究者曾经尝试冷冻样品，因为冰的蒸发速度要比水慢，但冰的晶体结构会扰乱电子束流，导致产生的图像是无效的。

　　水的蒸发问题让人为难，然而雅克·杜邦内特却看到了一个潜在解决方案：快速冷却水，使其在液态形式下固化，形成一种玻璃，而不是晶体。

　　玻璃材料是一种固体材料，但事实上却是液体，因为它具有混乱无序的分子排列。杜邦内特意识到，如果将水变成玻璃——也叫做“玻璃水”，电子束将均匀衍射，并提供一个标准背景。

　　最初，研究小组试图在零下196摄氏度的液氮中玻璃化微小水滴，但一直没能成功，最后用乙烷代替液氮后才最终实现，而乙烷本身则需要先用液氮来进行冷却。在显微镜下，他们观察到一种前所未见的情景。他们一开始认为这应该是乙烷，但是当液滴经过轻微加热，其分子却突然出现重新排列，形成了一种熟悉的晶体结构。这是一项重要的成就，因为当时很多研究人员认为不可能实现水滴的玻璃化，而现在我们认为，玻璃化的水是宇宙中最常见的水的形式。

　　一种简单技术提升对比度

　　在1982年取得技术突破之后，杜邦内特的研究小组快速研制一种基础性技术，该技术仍用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）。他们将生物样本制成溶液——期初是不同类型的病毒。这些溶液涂抹在金属网上形成薄膜。随后使用一种类似弹弓的结构将其射入液态乙烷快速冷却，从而使薄膜水玻璃化。

　　1984年，杜邦内特首次发布了不同病毒的结构图像，有圆形，有六边形。这些图像中病毒图像均与背景玻璃水存在清晰反差。到这里为止，生物材料就比较容易通过电子显微镜进行观察了。很快，各地的科学家们便开始前往杜邦内特的实验室学习这项最新的技术。

　　从“水滴学”到大变革

　　冷冻电镜最重要的问题是拍摄图像的质量较低。1991年，约阿希姆？？弗兰克使用杜邦内特的玻璃化方法成像核糖体，并使用自己的软件分析这些图像，他获得一个分辨率为40埃的三维立体图像。

　　这是电子显微镜领域令人振奋的一项突破，但是图像仅能显示核糖体轮廓。坦白地讲，它更像一团色块，分辨率上完全不能与X射线晶体学的原子级分辨率相提并论。

　　由于冷冻电镜除了观察不平整的表面之外，罕有用武之地，因此这种方法有时被嘲笑是“只能看见一坨东西的技术”（blobology）。

　　然而，很大程度上是由于理查德·亨德森坚信有朝一日电子显微镜将能够提供原子层面分辨率的图像并不断进行着尝试，电子显微镜技术经历着不断进步，它的分辨率正一埃一埃地不断改善，最后一个障碍在2013年被成功突破——一种全新的电子显微镜问世了（图六）。

图六

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　　洞察细胞的每个隐秘角落

　　现在，梦想已成现实。我们正面对生物化学领域的爆炸式发展。冷冻电镜的诸多优势使其具有了革命性的意义：杜邦内特的玻璃化技术使用相对容易，同时需要的样本量较少；由于快速冷冻过程，生物分子在过程中冻结，研究人员拍摄一系列图像，能够捕捉到该进程的不同部分。

　　通过这种方式，研究人员能够制作出一段段的“影片”，记录下蛋白质的运动，以及它们与其他分子之间相互作用的动态过程。借助冷冻电镜技术，分析细胞膜蛋白质结构变得前所未有的容易，而这些蛋白质往往与制药技术紧密相关，对于超大型分子团也是同样如此。不过，小型蛋白质仍然无法使用电子显微镜进行研究，但它们可以借助传统的X射线晶体学方法以及核磁成像技术进行研究。约阿希姆?弗兰克在1975年提出他的图像算法之后，一名研究人员曾经这样写道：“如果这种方法能够被最终完善，那么，用一位科学家的话来说，其前景将是一片坦途，无所阻碍。”

　　现在，海阔任鱼跃，天高任鸟飞——雅克?杜邦内特、约阿希姆?弗兰克和理查德?亨德森所研发的这项技术将带给人类最大的益处。我们将能够以原子层面的分辨率洞察细胞的每一个隐秘角落，生物化学将迎来一个光辉的未来！（来源：新浪科技 晨风，悠悠）

关于诺贝尔化学奖：

冷冻电镜单颗粒技术的现状与未来

　　来源：

　　编者按：瑞典皇家科学院宣布将2017年度诺贝尔化学奖授予三位科学家，瑞士科学家Jacques Dubochet，美国科学家Joachim Frank，英国科学家Richard Henderson，以表彰他们发展了冷冻电子显微镜技术，以很高的分辨率确定了溶液里的生物分子的结构！

　　在此，我们转发《物理》杂志的《冷冻电镜单颗粒技术的发展、现状与未来》一文，供读者了解相关研究情况。

　　1 引言

　　在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜（cryo-electron microscopy， cryo-EM）。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。

　　电子显微三维重构技术起源于1968 年，D.J。 De Rosier 和Aaron Klug 在Nature 上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4 噬菌体尾部三维结构的著名论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。Aaron Klug 本人也因为这个开创性的工作获得了1982 年的诺贝尔化学奖。

　　为了降低高能电子对分子结构的损伤，Kenneth A。 Taylor 和Robert M。 Glaeser 于1974 年提出了冷冻电镜技术，并且用于实验研究。经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力手段。冷冻电镜本质上是电子散射机制，基本原理就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，利用相干的电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。

　　在超低温的条件下，电子带来的辐射损伤被有效控制。即便如此，分子样品所能承受的辐射剂量也是非常低的，导致信噪比非常低。另外，随着观测的进行，额外的电子会累积而造成分子的移动，导致获得的图像变得模糊。这就好比用一个简单的傻瓜相机拍摄在雨中飞驰的子弹，得到的影像必然是模糊的并且充满噪音。因此，冷冻电镜的方法技术在很长时间内只能确定个头比较大的样品的结构，比如病毒颗粒的结构，而且通常分辨率都不高。然而随着工程技术和算法的不断发展，能够确定的分辨率也越来越高（图1（a）），2016 年发布的谷氨酸脱氢酶结构的分辨率甚至已经达到了1.8 ?。与此同时，也有越来越多的通过冷冻电镜技术得到的研究成果发表在高水平的期刊上（图1（b）），冷冻电镜正备受科学界的关注。

　　图1 冷冻电镜技术和单颗粒重构技术越来越备受关注（统计数据来源于EMDataBank ）（a）不同年份中利用冷冻电镜单颗粒重构技术能够达到的最高分辨率；（b）通过冷冻电镜技术进行的研究成果在不同杂志上发表的论文数

　　在最近几年，冷冻电镜技术有了革命性的进步，主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV 电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD 把光信号转成电信号后得到图像，“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量，同时，互补型金属氧化物半导体（CMOS）感光元件的应用使得探测器支持电影模式（movie mode），可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正，再把这几十张图片叠加起来，从而大幅提高成像的信噪比。模糊的子弹一下子变得清晰，冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模型重构框架解决了这个问题，我们在下文中详细介绍。综上所述，冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率，而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。

　　具有里程碑意义的成果是，2013 年加州大学旧金山分校（UCSF） 程亦凡和David Julius 的研究组首次得到膜蛋白TRPV1 的3.4 ? 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在Nature 上。我国在冷冻电镜的应用领域也有很大突破，代表性工作包括清华大学的施一公研究组和剑桥大学MRC 实验室Sjors H.W。 Scheres 研究组合作在2015 年获得的γ 分泌酶复合物结构（ 图2（c））， 以及2015 年清华大学高宁研究组和香港科技大学戴碧瓘研究组合作得到的3.8 ? 的真核生物MCM2-7 复合物结构；2015 年北京大学毛有东研究组、欧阳颀研究组与哈佛医学院吴皓研究组合作得到炎症复合体的高分辨率三维结构（图2（a））；2014 年中国科学院生物物理研究所朱平研究组和李国红研究组合作得到的30 nm 染色质左手双螺旋高级结构（图2（b））以及2016 年中国科学院生物物理研究所柳振峰、李梅、章新政三个研究组合作得到3.2 ? 的捕光复合物II 型膜蛋白超级复合体结构。这些成果在结构生物领域得到巨大的反响，这也使得冷冻电镜高分辨率成像技术获得空前的关注。

　　图2 我国在冷冻电镜领域中获得高质量的研究成果（a）近原子分辨率的炎症复合体结构（图中NBD为核酸结合结构域，HD1 为螺旋结构域-1，WHD为翼螺旋结构域，HD2 为螺旋结构域-2，LRR为亮氨酸重复序列）；（b）30 nm 染色质左手双螺旋高级结构；（c）3.4 ? 的人源γ 分泌酶复合物结构（图中NCT是一种I 型单次跨膜糖蛋白，APH-1 为前咽缺陷蛋白-1，PS1为早老素-1，PEN-2 为早老素增强子-2）

　　2 图像处理技术

　　经过多年的发展，目前冷冻电镜的数据处理部分主要包含了以下的流程（图3）：

　　（1） 衬度传递函数的修正（CTF correction）

　　（2） 样品分子投影数据的筛选（particle selection）

　　（3） 二维投影数据的分类和降噪（2D analysis）

　　（4） 三维模型的重构和优化（3D reconstruction and refinement）

　　（5） 多重构象的结构分析（heterogeneity analysis）

　　（6） 对重建结构分辨率的分析（structure resolution assessment）

　　（7） 结合生物化学原理和实验数据对三维结构的解读（model interpretation and validation）

　　图3 冷冻电镜数据分析处理流程

　　图像处理软件的发展对冷冻电镜单颗粒重构技术极其重要，当前广泛使用的电镜分析软件系统主要包括SPIDER，EMAN2， FREALIGN，SPARX，RELION等。对于刚刚接触单颗粒重构技术的人来说，更偏好集成的软件套装来完成整个分析流程。我们在表1 中列出了大部分主流的综合冷冻电镜图像处理软件，以供参考。

　　表1 冷冻电镜中流行的图像处理软件

　　2.1 衬度传递函数估计与修正

　　衬度传递函数（contrast transfer function，CTF）是在数学上描述通过透射电子显微镜得到样品图像上的像差变化。准确地判断衬度传递函数对于确认显微图像的质量以及后续的三维结构重建极为重要。常用的估算衬度传递函数的参数软件是CTFFIND4。确定了CTF 的参数以后，就可以对采集到的冷冻电镜图像进行修正。这个修正过程其实就是图像处理中的图像复原技术。

　　2.2 颗粒挑选

　　接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。

　　在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。

　　半自动和全自动的方法主要有以下三类：

　　（1）通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。

　　（2）基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。

　　（3）结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。

　　随着图像识别领域中深度学习方法的流行，各类基于深度学习的颗粒识别框架也被引入到颗粒挑选的过程中。随着深度学习方法的发展，相信如何把深度学习方法应用到单颗粒冷冻电镜图像分析领域的研究将会越来越多。

　　2.3 二维图像分析——颗粒图像的匹配与分类

　　二维颗粒图像的分类是获取三维结构过程的第一步。对二维图像的分析包括两部分：颗粒图像的匹配和颗粒图像的分类。

　　匹配的过程通常会对颗粒图像应用一些变换操作，通过关联函数去判断不同颗粒图像之间的相似程度。图像匹配的算法主要分为两种，即不依赖模型的方法和基于模型的方法，取决于是否存在利用样本先验信息得到的模板。

　　随着图像匹配的完成，颗粒图像需要进行分类。主要利用多元统计分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二维颗粒分类技术还有神经网络分类，将图像在二维空间自组织映射（self-organising mapping，SOM）再进行分类和排序。

　　二维图像分析的目的是，首先通过图像匹配消除旋转和平移的误差，利用类内紧致、类间离散的原则进行图像分类，最终可以对类内颗粒图像进行平均，提高信噪比，从而实现对高分辨率三维结构的构建。

　　2.4 模型重构和优化

　　模型三维重构的基础是中心截面定理，重构过程中的关键问题是如何确定每个颗粒图像的空间角（orientation determination）。大多数模型重构和优化算法都是基于投影匹配（projection matching）的迭代方法。简单说就是，先利用粗糙的三维结构模型，进行投影得到参考的图像，和实验颗粒图像进行比对，根据结果来更新空间方位参数，继而构造新的三维结构，对实验图像的空间方位修正，形成迭代的过程，直至收敛就获得了最终的三维模型。

　　2.5 分辨率的确定及二级结构的确定

　　在模型优化的过程中，通常有很多指标给出结构的分辨率信息。目前一个较为广泛使用的分辨率信息参数是被称为傅里叶壳层关联函数（Fourier shell correlation，FSC）曲线，并通过在曲线上选取一个合适的阈值来判定分辨率。

　　在模型优化中经常伴随着过拟合的问题。过拟合的出现通常由于在优化过程时无法分辨“噪声”与“信号”。为了避免过拟合对分辨率的误判，最近一种被称为“黄金标准”（gold standard）的优化过程开始被广泛使用。

　　根据不同的分辨率，可以从结构中得到不同的信息量。按照分辨率数值大致分为三个范围：

　　（1）结构分辨率大于10 ? 的生物大分子结构被视为低分辨率的结构，在低分辨率的结构范围内只观察得到一个大致的整体形状，以及有可能分辨出主要成分的相互位置关系。

　　（2）一个中等分辨率的生物大分子结构精度大约在4—10 ?之间，在这个分辨率范围内的生物大分子结构已经可以得到一些二级结构的信息和分辨出大部分组成结构的相对位置关系。分子结构之间如果存在构象变化也可以分辨出来。

　　（3）高精度甚至是近原子级别的分子结构分辨率可以达到4 ? 以下。在高分辨率的三维结构中，可以准确地看见如α肽链等的二级蛋白质结构以及部分单独的残基，多肽链的结构变得清晰起来。同时高分辨率的分子结构可以描述精确的构象变化。

　　总之，FSC 曲线等标准提供的分辨率是一个有指导意义的数字，不可作为绝对参考来评价所获得的模型质量，需要批判地对待，尤其是要与生物分子系统的生物化学知识相结合。

　　2.6 三维结构的多构象性和动态分析

　　生物大分子通常具有内禀的柔性，所以生物分子的动态结构变化以及结构的不均一性一直是结构生物学的研究重点之一。在晶体状态下，生物分子的结构变化被晶格约束，一般只提供一个静态的结构和有限的动力学参数。冷冻电镜相比晶体学方法的优势在于可以捕捉生物分子在溶液中的形态，并记录下不同构象下的投影。因此针对冷冻电镜的数据可以进行多构象的重构，现有的一些算法是通过聚类分析、最大似然法分析等对多构象进行分析，得到的生物大分子结构形态和构象差异还需要结合分子功能来检验分子结构的合理性。

　　3 最新进展和突破

　　3.1 最大似然估计理论

　　近年来在单颗粒分析中取得重大突破的应当是最大似然估计（maximum likelihood）理论。最大似然估计的理论可以贯彻整个单颗粒技术图像分析的过程，在图像匹配，2D、3D分类 和模型优化上均可以应用，是一个强有力的理论工具。最大似然估计的算法已经在RELION、FREALIGN 等软件中实现，方便普通用户使用，这对于推动冷冻电镜成像技术的应用有重大意义，近三四年来有许多突破性的近原子级别分辨率的分子结构大多是由基于最大似然估计理论的分析软件得到。

　　3.1.1 减少计算需求

　　最大似然估计算法的计算量很大，如何降低计算量是一个重要问题。过多的计算资源消耗曾经阻碍这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用。在减少最大似然算法在冷冻电镜应用中的计算需求方面，有两个重要的贡献是空间降维（domain reduction）算法和网格插值（grid interpolation）算法。

　　我们最近在研究一个新的方法来对旋转参数进行分步处理，初步的结果显示这种方法可以把计算复杂度降低一个维度，这个方法可很好地应用于高信噪比的数据处理，但对于低信噪比的数据分析还需要对该方法进行改进。

　　3.1.2 对最大似然方法的未来展望

　　在未来的研究中，关注点是减少计算的耗时和增加准确度。通用图形处理器（GPU）的应用和CUDA 编程框架已经显示出了在高性能计算领域的威力，研究表明GPU 技术可以显著减少计算时间，而RELION 也将发布支持GPU 计算的2.0 版本。

　　在加快计算速度的同时，提高模型的重构的准确性则更为重要。如何提高颗粒图像的准确性以及最大似然方法在这些方面的应用还有待深入探索。总而言之，最大似然方法独特的、可扩展的统计理论框架可以适用在冷冻电镜的各种问题上，如多构象、低噪声、信息缺失中均有很好的应用。

　　3.2 流形嵌入方法（Manifold Embedding）

　　自然界的分子过程通常是连续的，比如三磷酸腺苷（ATP）合成酶等分子结构的状态变化通常都是连续的。现有的方法只能得到有限的、若干个离散的构象变化，限制了我们对于分子结构的进一步观察。而流形嵌入法则是通过将颗粒图像映射到具有特定拓扑结构的参数空间（manifold space），可以分辨出更为细致的动力学变化，进而实现对生物分子连续的结构变化过程的研究。Ali Dashti 等人已经利用这种方法成功刻画出核糖体的结构变化路径。

　　3.3 揭开表面看实质

　　冷冻电镜对更为复杂的结构并没有很好的处理方式，在一些分子量比较大，包含多层的病毒结构研究中，一直没有高分辨率的三维模型，这也是由于病毒普遍具有对称失配的特性，基因结构被壳体完全覆盖，无法通过二维图形处理的方式对内部结构直接进行重构。刘红荣教授通过改进衬度分离方法展示出了解决该类问题的途径，其发展的新方法已经成功应用在一个多面体衣壳NCPV的病毒颗粒（图4）上，通过该重构方法，使得外部的衣壳结构（图4（a））和内部的基因组结构（图4（b））分离，成功得到包含在内部的dsRNA 近原子级高分辨率结构和分布。

　　图4 利用衬度分离方法得到对称失配情形下的病毒颗粒结构（a）外部的衣壳结构；（b）内部的基因组结构

　　3.4 罗马不是一天建成的（Building Protein in One Day）

　　最近的研究成果显示，最大似然估计算法能够更好更快地完成三维重构，多伦多大学的Marcus A。 Brubaker 教授针对最大似然估计算法提出了优化，有效地缩短了三维重构所需的时间。对传统迭代算法极度依赖于初始模型结构的缺点进行改进，同时通过采样优化的方式降低了计算量，减少计算时间，据称这些优化可以达到100000倍的加速，利用一台计算机工作站在一天内就能完成模型重构。

　　4 展望与总结

　　冷冻电子显微镜技术已经发展成为一个成熟的方法，应用于各种复杂的生物分子体系的高分辨结构研究。按照目前的发展势头，解决生物分子结构组（structural proteome）的问题已经不是遥不可及的了。在解决单一静态结构的基础上，冷冻电镜也展示了其研究多构象体系的潜力。下面对冷冻电镜在结构生物学研究领域的应用做一些大胆的展望，希望能抛砖引玉。

　　4.1 解决膜蛋白的结构

　　由于膜蛋白是镶嵌在磷脂分子构成的细胞膜内，目前在冷冻电镜领域的样品制备还没有很好的处理方法，因此还很少见到对膜蛋白的结构解析。随着技术的发展，新的试剂分子或者纳米尺度的容器可以用来制备单一性很高的稳定的细胞膜以及镶嵌在内的膜蛋白。这样就可以利用冷冻电镜的方法对膜蛋白进行结构研究。目前在纳米盘（nanodiscs）的研究领域已经取得了一定的进展，对

　　冷冻电镜解析高精度的膜蛋白结构，我们拭目以待。

　　4.2 细胞内分子结构测定：从溶液内（in vitro）到细胞内（in situ）

　　当前的高分辨分子结构基本都是在溶液中提纯出来的分子样品，也就是通常所说的in vitro 实验。现在可以利用快速冷冻的方法把细胞固定，再用高能粒子枪对细胞进行高精度切片。在细胞的某些部位，常常有大量同类分子聚集，比如在内质网（endoplasmic reticulum，ER）部分有很多核糖体，在细胞骨架上会有大量的肌动蛋白（actin）分子。对这些切片进行成像研究可以获取这些分子在细胞环境的结构信息。

　　4.3 细胞结构和分子在细胞内的分布：从部分到整体

　　电镜可以用来做断层成像（cryogenic computed tomography，cryo-CT），应用于亚细胞层面的研究，比如细胞器的结构，蛋白质分子的分布，以及一些细胞骨架的构成。与超低温样品操作结合，cryo-CT 可以提供更高分辨率的信息，衔接分子层面和细胞层面的知识，对于了解细胞功能至关重要。在电镜成像研究领域，这将是一个有广阔前景的课题。

　　4.4 多构象的识别和自由能景观确定

　　人们开始不满足于近原子级别分辨率能够提供的信息，想要进一步刻画分子结构连续变化的状态。得益于冷冻电镜的成像特性，相对其他技术而言，冷冻电镜技术在时间尺度的系综上具有优势。在冷冻电镜下分子结构的动力学研究中，有两个值得关注的趋势，分别是能够获取分子结构“ 慢” 反应过程（10—1000 ms） 时间分辨（time-resolved）的冷冻电镜技术，以及能够分析出连续构象变化的分类算法。获取短期反应过程（10—1000 ms）分子结构的基础是在准备样本过程中分子反应的速度慢于冷冻样本的时间，目前混合喷雾（mixing-spraying）等快速冷冻技术的实现使得一些较慢的反应过程可以看到动力学变化。而流形嵌入算法在分类过程中取得突破，在更好地利用冷冻电镜观察分子的平衡态结构动力学变化和展现自由能景观上取得了令人鼓舞的成果。

　　4.5 从静态结构到动态分子电影

　　生物分子在室温下是活跃的，而且大多数的分子功能是通过结构的变化来实现的。基于X射线， 尤其是最近发展的X 射线自由电子激光（XFEL）的结构生物学的研究重点之一便是实现时间分辨的结构生物学研究（time-resolved structure determination）。到目前为止，基于X 射线的研究取得了很大的进展，但主要还是局限在对晶体的衍射方面，比如对光合作用过程中水分子分解的研究和光敏黄蛋白的光吸收过程的研究。三维冷冻电镜的单颗粒成像技术最有希望在单分子水平上实现对时间分辨的结构变化研究，同时，这对于样品制备和实验操作提出了非常高的要求。

　　5 结束语

　　冷冻电镜的技术突破及其在生物分子结构领域的应用把我们对分子生物学的研究推进了一大步，开始探索未知的区域。立足于解决单一构象的基础，对多构象以及动力学过程和热力学的研究也需要展开，这需要对现有技术进行提升并与其他方法进行结合，计算建模和模拟的方法也需要紧密结合起来，实现对生物分子系统的集成研究。

　　来源：《物理》2017年第2期

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