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干货II快速、高效的筛选功能性添加剂,我们这样做!!!

浩华生物 2020-11-20 11:13:09

饲料企业的研发,最头痛的莫过于如何快速经济的在茫茫大海中去筛选得到适合自身的功能性添加剂产品了。


促生长一类的功能性添加剂,一般就是直接动物试验看养殖效果,结果好也就罢了,一旦结果不理想则是精力金钱上面的大量消耗。

替抗一类的添加剂筛选还好,往往由体外到体内两步走,体外试验大大降低了筛选范围,但是动物试验的效果往往与体外试验存在偏差,这就导致容易出现错判而错过好的产品。

如何实现快速、高效的筛选功能性添加剂是所有饲料研发工作者所需要思考的问题!

做研究,模型很重要,传统的筛选方式一般直接采用养殖动物饲养试验作为模型,成本高、周期长、不确定性高等等极大的制约了饲料研发的发展。

随着生物技术的发展,细胞分子水平研究的深入,目前养殖动物体相关的细胞系已经建立,已细胞系培养为基础,建立相应模型机制将大大提高功能性添加剂的筛选效率及其准确性。

这里详细介绍以肠上皮细胞IPEC-1细胞系为基础的一种益生菌的筛选方法供大家探讨。

 

1  背景

肠毒型大肠杆菌引起的肠道感染是养猪生产中常见疾病,严重影响仔猪生长,给企业造成重大经济损失。在导致仔猪腹泻的大肠杆菌中,以大肠杆菌K88最具代表性,使用大肠杆菌K88作为指示菌株会更好的体现实际应用的价值。传统上大肠杆菌病主要靠抗生素防治,由于耐药性与残留问题,抗生素的使用被严格限制乃至全面禁用。益生菌是最有效的抗生素替代品之一,因此如何快速筛选高效的益生菌具有重要意义。

侯永清(2013)成功建立以脾脏细胞或者小肠上皮细胞IPEC-1为受体、大肠杆菌K88为指示菌株的一种益生菌的体外筛选方法。参照侯永清教授方法,以肠上皮细胞IPEC-1为受体、大肠杆菌K88为指示菌株,选择乳酸脱氢酶(LDH)作为测定指标,可以直观的反映肠道中益生菌对大肠杆菌K88损伤肠道的缓解作用。

2  可行性分析

乳酸脱氢酶LDH是一种糖酵解酶,存在于机体所有组织细胞的胞质内,细胞培养液中LDH含量是可以客观衡量细胞破损层度。方法通过体外检测细胞培养上清液中LDH的含量来判断几种益生菌对大肠杆菌K88感染小肠上皮细胞IPEC-1的保护作用,筛选出可以控制猪肠毒型大肠杆菌的益生菌。

 

 

3  技术路线

技术路线图如下所示:

 

 


 


 


4  实验材料与仪器设备

4.1  实验材料

DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、乳酸脱氢酶LDH检测试剂盒以及常规实验耗材。

4.2  主要仪器设备

37℃恒温CO2细胞培养箱、全自动细胞计数器、恒温振荡培养箱、全自动紫外分光光度计、iMAKE酶标仪、WH-2微型涡旋混合仪、超纯水机CSR-1—05、小型高速离心机等

5  主要实验步骤

本方法主要包括以下实验步骤:

a.肠上皮细胞IPEC-1细胞培养;

b.用大肠杆菌K88进行攻毒,并接种一定量的益生菌,测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量变化;

c. 通过毒力分析,得到益生菌对大肠杆菌K88毒性的缓解作用强弱程度,进一步通过体外抑菌实验,比较体外抑菌实验与细胞毒性实验结果的一致性,确定目的益生菌菌株。 

注意事项:

1. 对细胞培养而言,益生菌也可以被认为是细菌,会与细胞产生营养竞争,所以在培养时间上一定要控制在合理的范围内,减少营养竞争对试验结果的影响。

2. 一定要在细胞状态较好的时候开始本次试验,减少细胞自身凋亡对试验结果的影响。

3. 试验前期菌株的培育以及数量级曲线的建立到整个试验确定最后结果,试验周期在两周左右。


                       实例展示

试验将大肠杆菌K88分别与泛微素BC(凝结芽孢杆菌)、干酪乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌一起接种到体外培养的猪小肠上皮细胞(IPEC-1)上,测定2.5 h之后的培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性,乳酸脱氢酶(LDH)相对活性与细胞死亡数量呈正相关,即乳酸脱氢酶活性越高,大肠杆菌对猪小肠上皮细胞毒性越高,试验结果见表1

表1 益生菌对细胞上清液中LDH活性影响

注:同列数据肩标字母不同表示差异极显著(p<0.01),部分相同的表示差异不显著(p>0.05),下表相同。

    由表1可知,泛微素BC(凝结芽孢杆菌)可以极显著降低细胞上清液中乳酸脱氢酶的活性,能够极显著降低大肠杆菌K88对猪小肠上皮细胞的毒性,起到保护小肠上皮细胞的作用,其效果优于干酪乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌。

用这种直接与受体细胞直接接触的方式来筛选产品的方式,准确性大大提升,试验周期短,可行性高,只要细胞培养的量足够,一次可以进行大批量的产品筛选。再此基础上,再进一步进行动物试验验证准确性更高。


新技术、新理念与实际生产相结合,必将为功能性添加剂的筛选开辟出一条快速、高效的快速通道!


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