【健康课堂】小核酸的大时代

这一项1998年发现的创新技术，为药物开发和生物技术公司采用强大的RNA沉默机制来治疗疾病提供了有力的工具。在2006年获得诺贝尔奖之后，全球医药巨头大举进入这一领域，期望通过先发优势提升企业长远发展的竞争力。然而，由于药物导入难题限制了药物的作用效果，2009年OPKO公司终止了Bevasiranib（Cand5）的Ⅲ期临床研究，这一药物由于缺乏导入系统，对失明的治疗作用效果不明显；随后，由于显著的脱靶效应，Allergan也没有继续实施AGN-745（Sirna-027）的二期临床研究(Burnett JC 2012)。从2010年起部分制药巨头相继退出或者缩减在该领域的投入，罗氏制药在投入超过5亿美元之后终止了小核酸研究项目，诺华终止了与Alnylam公司长达5年的合作关系，辉瑞也缩减了相关的研究部门，而默克也削减了基于原Sirna公司构建的在旧金山的研发部门。

不过，仅仅四年之后，这些制药巨擘再次重燃对小核酸药物的热情。2014年初，尽管默克宣布将2006年11亿美元“高价”收购的Sirna公司以1.75亿美元的价格出售给Alnylam公司，彻底撤出对这一领域的投资。但这一行动对其他医药投资者对小核酸药物开发行业的热情没有任何负面影响。罗氏与丹麦的Santaris公司联合开展RNA沉默药物，Genzyme与法国赛诺菲制药投入7亿美元，用于Alnylam公司小核酸药物的开发(EC 2014)。而Dicerna制药公司在2014年的上市，似乎也意味着RNAi治疗即将迎来再次的黄金时期。

一般说来，假如医药投资界大举进入某一个领域，那说明这一领域的春天即将到来，而目前的小核酸药物领域正是处于这样的阶段：如果说2006年诺贝尔奖带动的投资热潮具有业界“冲动”的成分，那么，过去几年小核酸药物临床研究的进展和药物导入技术的突破多带动的新一轮投资热潮，则是产业发展的理性选择，是科学的理性，也是多项临床实验成功实施的结果。“RNAi的时代已经来临”，摩根大通证券公司的生物技术行业分析师Michael King如此高调宣称。而纽约Needham&Company公司的分析师Alan Carr认为，随着Alnylam在该领域的长足进步，多个药物不断获得良好的临床研究结果，显示了小核酸药物的巨大发展潜力，“是时候让大型制药公司再次意识到RNAi治疗的巨大威力了”(N 2014)。

人类基因组计划的完成，的确为生物医药产业的发展带来了巨大的机遇。但是决定人体复杂性（包括各种疾病）的并不是已经被测定的、看似数量巨大实际上并不算多的两万多个基因。相反，基因调控过程，即各种基因在不同时间和位置的开启和关闭，在不同时段表达的强弱，都受到多种通路的调控，这才是决定人体复杂性的关键所在。在各种调控分子中，核糖核酸（RNA）发挥着重要作用，其中就包括小干扰核苷酸（siRNA）和微干扰核苷酸（miRNA），前者是机体对抗外来病原菌（特别是病毒）的保护机制，后者在生物体的生长、发育、分化、繁殖和凋亡等过程发挥重要作用(Ameres SL 2013)。

当人体基因表达成蛋白质的过程发生异常，或者受到外来病原菌的侵入或感染时，必须有合适的机制来校正异常基因表达或者对抗病原菌，否则将会导致人体疾病。小分子药物和单克隆抗体/蛋白药物只能通过空间结构的互补等机制与靶标结合，影响已经合成的蛋白质的功能，所以其针对的靶标受到极大限制，经常看到无法找到与致病基因表达的蛋白质相互作用的小分子或抗体的情况。而siRNA和/或miRNA是在信使RNA（mRNA）水平抑制基因表达，不产生或者很少生成引起疾病的蛋白质，从更为根本的角度来治疗疾病(Fellmann C 2014)。正如Alnylam公司CEO、生物化学家约翰·马拉格诺（JohnMaraganore）形象地说到，“现有的药物只是被动地把水擦掉，而RNAi则是直接把水龙头关掉”。而且，理论上，只要致病基因的DNA序列明确之后，就可以设计特异性的siRNA或miRNA来抑制该基因的表达，理论上可以用于多种疾病的治疗，包括癌症、、神经退行性疾病和心脑血管疾病，也包括那些小分子和单克隆抗体药物无法治疗的疾病(Wu SY 2014)。由于siRNA以“一对一”方式起作用，其特异性高于miRNA，后者是“多对多”的作用方式，在调控准确性和精度方面有待优化，且miRNA只针对3’端非翻译区（3-UTR），而siRNA可以针对非翻译区和编码区，在设计时具有更多的选择性。因此，目前siRNA治疗药物开发比miRNA药物产业化进度更加靠前，已经有全世界已有20多个品种的创新小核酸药物正在实施三十多项不同阶段的临床实验(KubowiczP 2013)。

曾经因为诺贝尔奖光环的笼罩，核酸干扰技术在一夜之间成为炙手可热的明星，正是那一场热潮夹带着行业的乐观情绪，带动了2006年开始的并购与投资热潮，在各大媒体煽风点火式的协助下，默克、罗氏、诺华、辉瑞等巨头都大展拳脚，似乎所有人都想在这一新兴行业中拔得头筹。然而，整个行业很快就认识到，未经修饰的小核酸不稳定，在血液中很快被酶解，无法穿过机体内的各种屏障，必须对小核酸进行修饰，或者采用特定的材料来保护这些“脆弱”的分子。而修饰技术经过多年研究，似乎并不能彻底克服小核酸不稳定和免疫刺激的问题，因而，安全有效的小核酸导入系统（Delivery System）的开发，迅速成为工业界和科学界的研究热点，也称为限制行业发展的瓶颈技术。在这一技术被突破以前，正是2010-2011年期间一些大型制药巨头缩减小核酸研究开支甚至退出小核酸领域的阶段。

然而，事情永远不是绝对的，科学技术的发展永远不会停步，行业的发展瞬息万变。近年来，诸多企业选择表皮、眼部和肺部疾病这类可以通过局部给药方式治疗的适应症率先推动小核酸药物产业化；同时，纳米医药技术，特别是各种新型纳米导入系统的成功开发和临床应用，成为近期推动小核酸药物行业迅猛发展的主要原因(Zhao J 2013)。按照行业公认的观点，一个用于系统给药的良好的导入系统，必须具备多项条件：（1）有效对抗血清中核酸酶降解的稳定作用、（2）避免激活人体的免疫系统、（3）避免与血清中蛋白或非特异性靶细胞的相互作用、（4）在发挥有效前应防止被肾脏清除出体外、（5）能够透过血管壁进入靶标组织、（6）有效穿透细胞膜进入细胞和（7）在细胞质中将小核酸释放出来发挥核酸干扰机制。总而言之，好的导入系统既要能高效携带并保护siRNA，又要安全无毒副作用，最好还要生产工艺简单。说出这些要求很容易，然而要做到这一点，却是科学家和产品经理们长期奋斗才有可能完成的任务。

在选择导入系统时，有部分研究者和新药开发单位选择病毒性载体，但是这类载体具有很强的免疫原性，插入致突变型的风险和潜在的令人担忧的生物危害，在临床用于治疗疾病时面临诸多问题。因而，经过良好设计的、具备主动靶向或被动靶向性的费病毒类多功能纳米导入系统，逐步成为小核酸药物产业化发展的强大推动力。目前无论是学术界还是工业界，都在脂质体、胶束、合成有机聚合物（如多肽、聚乙二胺、Dendrimer和环糊精等）、无机物（如碳纳米管、量子点和金纳米颗粒等）开始发力，出现了众多高效安全的导入系统，从而极大促进了小核酸行业的发展，更带动了科学界、工业界和投资界对这一领域的未来重新充满巨大的信心。

麻省理工学院教授Paula Hammond认为：“设计一种导入系统以掌控siRNA的命运，这的确是一项有着巨大挑战的工作，特别是你想靶向身体的特定部位时更是如此。”Hammond及其同事长期致力于药物导入系统的开发，2012年该团队开发出一种新型导入系统，siRNA被紧密装载在微球内，在到达靶标组织前可以有效避免小核酸被降解，而且在更小剂量情况下获得与现有的导入系统相同的基因沉默效果(Lee JB 2012)。

而同样是来自麻省理工学院癌症研究所的另一组研究人员，开发了一种针对肝脏细胞的高效特异性强的脂质多肽cKK-E12，在小鼠（约0.002mg/kg）、大鼠（<0.01mg/kg）和非人类灵长类（0.3mg/kg的沉默效果超过95%）均取得良好的基因抑制效果。其对肝脏的特异性比对内皮细胞和免疫细胞高几个数量级，且1mg/kg（的100倍以上）无显著毒性(Dong Y1 2014)。

而在另一项研究中(Dahlman JE 2014)，低分子量多胺和脂质聚合纳米颗粒7C1可以将siRNA高效导入到内皮细胞，为同时抑制多个内皮基因的表达提供了便利条件。不同于脂类或脂质纳米颗粒，这一系统在发挥内皮细胞基因沉默的剂量下不会降低干细胞或免疫细胞的基因表达。这是目前作用最持久的非肝脏靶向siRNA导入系统，可以调节包括血管渗透性、气肿、原发癌症生长和扩散在内的多种内皮细胞功能。0.1mg/kg抑制效率超过90%，0.02mg/kg抑制效率达50%。

与学术界有所不同的是，工业界开发的导入系统则更为实用，直接与药物的临床研究紧密连接，不但考虑创新性，更多的是将围绕高效低毒和工艺制备过程作为核心要素，且更加重视整体导入系统开发技术平台的完善和标准化。

Alnylam公司治疗淀粉样变性的药物ALN-TTRsc，将糖分子GalNac（N-乙酰半乳糖胺）偶联在小核酸上形成GalNAc-siRNA，是Alnylam公司独有的肝靶向特异性投递系统。在非人类灵长类动物中，ALN-TTRsc以2.5mg/kg/天的剂量，皮下注射给药一周，有效抑制循环系统中甲状腺素运载蛋白（TTR）达70%以上，300mg/kg的剂量并不诱导细胞因子表达、激活补体或产生其他副作用。这是一项证明核酸干扰药物皮下给药治疗可行性的重要验证工作，Alnylam采用这一导入系统开发的其他候选新药也取得了很好的疗效。

Tekmira与Alnylam合作，采用稳定的核酸-脂质纳米颗粒（SNALP）开发多项小核酸药物，这一导入系统将聚乙二醇（PEG）偶联到脂质体上，将siRNA包裹在由阳离子脂质和中性脂质构成的双层脂质膜内。与传统的脂质体相比，SNALP在血浆和肝脏中有更长的半衰期，这一导入系统是迄今为止脂质体在siRNA导入方面最成功的应用(JJ. 2006)。

Sirnaomics公司采用组氨酸-赖氨酸（HK）多肽作为体内导入小核酸药物的载体，通过质子海绵效应促使内涵体破裂后将纳米颗粒内的siRNA释放出来，在多个候选新药中取得良好的治疗效果，安全无任何显著毒副作用(Leng Q 2009)。

Calando制药公司（现已成为Arrowhead公司的一部分）设计了一种表面连接了转铁蛋白（transferrin）的纳米颗粒，可以与肿瘤细胞表面的转帖蛋白受体特异性结合，用于治疗转移性黑色素瘤。

导入系统可以提高小核酸药物治疗的效率，通过靶向运输降低非特异性的导入，当然更重要的是可以保护运输过程中药物被降解掉。通过将靶向配体结合到纳米颗粒上，增加了小核酸药物到达疾病部位（实际应用中最多的是肿瘤）的几率。未来，只要科学界和工业界继续保持对安全高效、生物兼容性好、生物可降解的纳米导入系统的投入和开发，攻克了瓶颈技术难题的小核酸药物必将为世人展示其在药物发展史上具有的革命性的一面。

2004年，即仅仅在哺乳动物中发现核酸干扰机制(Elbashir SM 2001)后三年，首个小核酸药物（OPKO公司治疗老年湿性黄斑的Cand5）便进入了临床研究，虽然这是一项未能最终获得成功的候选新药，但其临床研究却开启了小核酸药物人体试验的大门。在2008年前，8项进入临床研究的药物只有1项是系统给药，但随后的四年，有一半（7/14）新进入临床的药物是采用系统给药方式治疗，这也表明导入系统的开发大大推动了小核酸药物通过系统给药治疗各种疾病的可能性。

截至今日，根据临床实验数据库（ClinicalTrials.gov）显示，有超过30项基于小核酸的药物进入临床研究，所治疗的疾病包括肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和遗传疾病等。这些临床试验结果显示了小核酸药物对特定疾病的良好的治疗效果和可靠的安全性，，可以预见，未来的两年内，第一个小核酸药物将会被批准上市，当然，首先上市的是局部给药的药物，更可能是针对眼睛或肺部疾病的治疗药物。

局部给药（表皮）：表皮给药由于直接方便，针对皮肤的疾病适应症也理所当然成为小核酸药物开发的领域之一。RXi制药公司的RXi-109，采用小核酸抑制结缔组织生长因子（CTGF），用于阻止表皮瘢痕形成，目前已经启动Ⅰ期临床研究。在国内，苏州圣诺生物医药公司和广州香雪制药集团联合开发的治疗增生性瘢痕的创新药物STP705，通过同时抑制两种与纤维化有关的基因，取得显著的抑制增生性瘢痕形成的效果，也已经向CFDA提交了一期临床研究的申请资料，该药物未来可以进一步拓展到用于再生医学领域的其他纤维化疾病的治疗。由于皮肤给药属于局部给药，且治疗效果易于观察，比其他给药方式成药性更好，未来针对表皮疾病的小核酸药物有可能后来居上，超越其他给药方式的小核酸药物而成为最快上市的siRNA药物。

局部给药（眼睛）：这是最早发展起来的一类核酸干扰药物，目前多个药物进入了Ⅱ/Ⅲ临床研究，因此未来也最可能是最早上市的小核酸药物。辉瑞公司投资参与的Quark制药公司的小核酸药物PF-655(Lee DU 2012)，靶向RT801基因，用于治疗老年湿性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变（DME），按计划进度目前已经Ⅱ期临床研究，但尚未见到研究的数据公布。前瞻性随机Ⅱ期临床试验结果显示：在第12个月的中期结果显示没有与药物相关的严重不良反应。随后12个月以PF-655治疗观察到剂量依赖性视力改善，3 mg剂量水平达到最佳效果。来自西班牙的Sylentis公司的用于治疗青光眼的小核酸药物SYL040012，通过设计特异性siRNA阻断b2肾上腺素受体（ADRB2）。减少房水产生，降低眼内压，是一种滴眼液剂型。该药物滴入眼内后siRNA可以迅速分布到眼睛前部的各处组织内发挥作用(Martínez T 2014)，目前正在实施Ⅱ期临床研究，已有的数据表明药物安全可靠，无显著毒副作用。Quark制药公司的QPI-1007，采用siRNA抑制凋亡蛋白Caspase-2来促进神经节细胞凋亡(Solano EC 2014)，用于治疗前部缺血性视神经病变和其他青光眼的视神经疾病，目前已经完成Ⅰ期临床研究，正在进行ⅡA期临床试验。此外，Quark公司与国内的瑞博生物医药公司合作并成立子公司，推动该项药物在中国的产业化，目前已经向CFDA提交了国际多中心临床试验。

局部给药（肺部）：Alnylam公司的ALN-RSV01，是一种采用小核酸靶向抑制呼吸道合胞病毒的核衣壳蛋白（NP）基因表达的药物(DeVincenzo J 2010)，已经完成Ⅱ期临床研究，显示了核酸干扰技术在抗病毒（首先是呼吸道病毒感染疾病）治疗方面所具备的良好的应用前景。此外，ZeBeCor公司开发的Excel lairÔ利用小核酸靶向抑制脾脏酪氨酸激酶（STK），用于治疗哮喘，药物安全性较好，预期应用前景广阔。

局部给药（瘤内）：Silenseed公司的siG12D采用生物可降解材料装载针对KRASG12DmRNA的小核酸，通过内视镜超声波手段将药物注射入胰腺肿瘤内局部，药物作用时间可持续8周，这是在静脉注射之外尝试的另一种系统给药方式基本成功的证明。

系统给药：目前系统给药方式的临床研究有9项，基本上都处于Ⅰ期临床研究阶段，只有个别药物（ALN-TTR02）进入了更晚期的临床研究。系统给药的小核酸药物其中多数是静脉注射给药，且多以肝细胞作为最终的导入靶点。Alnylam公司用于治疗转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性（ATTR）的ALN-TTR02采用第二代脂质体导入系统，目前正在实施Ⅲ期临床研究。该药物2013年完成的Ⅱ期临床试验表明(Coelho T 2013)，ALN-TTR02可以显著降低血清中TTR水平达93%以上，而TTR被抑制以后，淀粉样变性被快速、持续、剂量依赖性的方式缓解，且临床安全性和耐受性良好。Calando公司的CALAA-01采用siRNA靶向抑制RRM2（核糖核苷酸还原酶M2亚单位），该酶负责将核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸，是DNA合成和复制所必需的蛋白酶之一。通过药物特异性抑制肿瘤部位该酶的活性，可以高效治疗实体瘤。收购Calando公司后，ArrowHead公司大力发展小核酸药物。该公司用于治疗乙型肝炎病毒感染的小核酸药物ARC-520，即将实施Ⅱ其临床研究(Sebestyén MG 2015)。Tekmira公司的抗埃博拉病毒感染药物TKM-EBOLA，采用第三代脂质体导入系统，按正常流程应该处于Ⅰ期临床，但2014年下半年获得FDA授权在紧急情况下可以用于临床治疗。

科学发展的规律，决定了小核酸技术的临床应用也必然会经历曲折和波动，或许不是被鼓吹出巨大的泡沫，就是其价值被严重低估。任何一种药物，都是在经过无数次失败的临床试验之后，才取得最终的成功，从而大大推动人类健康事业的发展。正是在两个极端趋势中不断游走，才导致了一个又一个的巨大科学发现给人类带来无可估量的价值。

即便是当今如日中天的单克隆抗体药物，也经历了曲折的发展过程。1975年杂交瘤技术出现之后，人们将这一对抗原高度特异性识别的“魔弹”技术非常乐观，而1982年首例单抗用于治疗B细胞淋巴瘤取得成功后，催生出许多以单克隆抗体为研究对象的企业(S 1998)。然而，随着更加深入而广泛的研究，许多在动物模型中具有强烈抑癌效果的单克隆抗体在临床应用中却屡遭失败，学术界和工业界的研究热情开始减退，科学家们也开始反思单抗临床应用中需要解决的问题。1994年，用于治疗风湿性关节炎的抗体Campath 1H的产业化因为其显著的毒副作用和潜在的抑制免疫系统效应而被迫中止，科学界原本就已经低落的情绪更是雪上加霜，工业界对治疗性抗体的研究也陷入低谷。然而，当限制产业发展的免疫源性技术难题经过人源化改造方法攻克之后，单克隆抗体药物的黄金时代才得已降临(Holliger P 1998)。目前，以Humira和Remicade为代表的单抗药物以年销售额几十亿美元成为医药界的“重磅炸弹”，而且这一领域已经发展到全人源单克隆抗体阶段，已经上市的全人源单克隆抗体药物超过十种，在临床治疗上发挥巨大的作用。

现在，认识到核酸干扰技术所拥有的巨大治疗潜力的时刻已经来临。从实验室的学术研究、药物的临床验证、工业界对小核酸治疗的热情剧增以及投资界资本的不断涌入，我们有理由乐观地推测，作为核酸干扰技术核心效应分子的小核酸，正在迎来属于自己的时代，一个改变生物医药未来三五十年发展格局的新时代。