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你在进行液相色谱分析时，首先要做好的事情就是配置好流动相，流动相的配制也不见得那么简单。在进行液相色谱分析时流动相需具备哪些特点？高效液相色谱法流动相你要如何配制等一系列问题，本文会为您解答。。。
首先，你需要了解液相色谱中流动相需具备哪些特点。
液相色谱中流动相需具备哪些特点？
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
流动相调制方法不同，对分析结果会产生显著影响！
（小析姐毫不客气的以高效液相色谱法中的流动相为例！）
高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液，但是如何配制？别不重视！因为，选择配制的方法不同，分析结果，特别是保留时间，是会有显著差别的!
溶剂：高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液，水性溶剂也常用于缓冲液。常因资料上表示的内容和实际的配制方法不同，而产生流动相的差异，影响了色谱图和分析结果。一般来说，溶剂的混合按体积比（V/V）或重量比（W/W）进行。溶液的体积因温度而变化，所以按重量比混合可调制再现性较好的混合溶剂，但由于操作较麻烦，通常多用体积比混合。只要没有特别标明，就可按体积比进行混合，但在特殊情况下，如，胺类粘度高的溶液混合时，有时用重量—体积比（W/V）的方法。
一、有机溶剂和水性溶剂的混合方法
有机溶剂和水性溶剂的混合液作为流动相是经常的，但由于混合方法不同，有时分析结果相差很大。如20mM磷酸钠缓冲液（pH2.5）90%与乙腈10%的混合液，混合比为9∶1时，20mM 磷酸钠缓冲液（pH2.5）90%与乙腈10%的体积比为9∶1，也就是可以解释为各自按体积比例的相当量称取后进行混合。另外，按10%乙腈解释，用20mM 磷酸钠缓冲液（pH2.5），将乙腈稀释调制也可以成立。在后者情况下，产生混合体积减少部分，余下的添加20mM 磷酸钠缓冲液。两者虽然没有太大的差别，但由于混合方式不同，分析结果，特别是保留时间，
也会有显著的差别，这点必须注意。
二、50%或（V/V＝1/1）乙腈水溶液的配制方法
对于用V/V＝1/1的表示配制乙腈水溶液，多按这种方法进行：用量筒测定乙腈500mL，用另一量筒测定水500mL，两种液体在瓶内充分摇晃混合。不过 50%乙腈水溶液的表示时，同样也多是按上述方法配制，但查化学辞典时，实际上是按这种方法进行配制：首先将500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶边搅拌边加水，等待液温达到室温，用全量水，使溶液到1L。这样一来，用%表示和“V/V”体积比表示，最终得出的流动相组成不同。也就是说，混合溶剂的密度，与由原溶剂密度计算的单纯平均值不相同，所以用上述两种方法调制的流动相组成差异。如在室温（25℃）附近水50mL和乙腈50mL混合时体积不是100mL，而有所减少，约为96mL。在一般情况下，多用操作简便的第一种方法。
三、溶剂体积的温度影响
如前所述，溶液的密度受周围温度的影响。刚从溶剂冷藏箱拿出来的溶液温度与实验室的室温相比，要低不少，乙腈和水混合液因发热反应，溶液温度升高。因此，为能调制再现性好的流动相，建议在使用前用水浴（或热水浴）将液温调到接近室温。
四、用两台泵进行溶剂混合
在反相分析中，常用的有机溶剂和水的等浓度法，使用高压两元梯度系统，用两台泵将流动相分别输液后混合等封闭式混合时与预先在瓶内混合后用1台泵输液时，因混合后体积变化的不同，保留时间也有所不同，一定要注意。不仅是流动性的调制方法，试样溶液和其他溶液的调制也经常有上述问题，另外，在不同部门（医药部门或化工部门）各自都有自己的常识和习惯。在这种情况下，就要求各部门在制作相关溶液配制方法时能规定通则，定义设计溶液的调制方法，这样避免混乱，以在日常工作中更好地记住这些表示方法。
HPLC中流动相的配置你必须注意以下几点。。。
流动相的选择
流动相的混合
双泵主要是在探讨流动相的配比或者梯度洗脱是比较方便，知道确切的液相条件时，建议配好后使用的话，混合比较均匀，效果较好。
脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。
系统中气泡的产生：流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡；
气泡的影响：存在于管路中，系统压力不稳定，实验结果有偏差；
存在于单向阀中，易造成液体回流，流量不准确，甚至是不吸液；
存在于检测器中，出现鬼峰，影响检测准确性。
所以做液相对流动相的气泡和杂质要求比较严格。气泡会影响柱的分离效率，检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如，甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。
常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。
1.氦气脱气：氦气脱气是很有效的脱气方法。氦气缓缓的通过流动相赶去溶入的空气，如果使用得当，在10min内可除去80%～90%的溶入气体。由于氦气在流动相中的溶解度极低，所以用氦气脱气保护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。其缺点是氦气价格比较昂贵，会增加检验成本。一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。
2.真空脱气：也是比较常用的脱气方法。现在多数企业都最常用这种办法，贮液器被抽成部分真空，溶入的气体蒸发形成气泡溢出，其效果仅次于氦气脱气。象Agileng1200液相色谱使用的是在线脱气机。在线脱气只适合脱完气之后的流动相，在使用过程中的微量脱气。
3.超声波脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10～20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。这种方法只能除去30%的溶解气体，有时还会引起气体溶解度的增加。对氧敏感的检测器不宜用此法。
超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），关于超声时间问题众说纷纭，各实验室内5～30分钟不等，一般来说流动相组成为无机（缓冲盐溶液）时，5～15分钟即可，流动相为是水和有机容积混合时，超声时间要相对长一些，这个方法只能除去30%的溶解气体，时间的延长不和效果成正比，且其中气泡对色谱峰基线稳定性与信噪比有一定影响，一般来说影响不大，15min超声即可足够。此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
4.加热回流脱气：该方法虽然效果很好，但是适用范围较窄。对于有机溶剂或混合流动相不适合用此法，因为挥发性组分会损失掉，改变流动相的组成。
综合来说，用真空抽滤后，再用超声脱气还是最常用的办法，用氦气的方法是效果最好的办法，而在线脱气本身也是真空脱气，但它可以放到仪器上使用，是一种保证性的办法。
A.离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。
B.在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
样品配置的小妙招：
1.选用流动相配置对色谱峰影响最小
2.流动相溶解度达不到要求时，尽量选用流动相中含有的比例较大的成分（有待考证），以减轻进样对流动相的影响造成基线不稳。
3.流动相组成溶剂均达不到要求时，选取的溶剂应保证在设定波长内无紫外吸收。
流动相的PH
如，需在一定PH值下操作，须定期测定流动相的PH值，大气中的CO2溶解在流动相内将引起PH值的改变，特别是贮液瓶密闭不严时这种影响可能更大。
更换柱子及流动相
软质或半软质填料的溶胀率随溶剂极性的变化而变化，使用新柱时应先用25~30倍柱容积的合适流动相平衡；更换流动相时，如果两种流动相不互溶，需采用过渡溶剂使前一种流动相逐步溶解除去，（例如，2、2、4-三甲基戊烷换成甲醇时，必须用乙酸已酯或其他溶剂过渡，直到标准物保留值达到稳定状态）。
小结
流动相配制，有很多你需要注意之处，通过本文的阐述，你了解了吗？
参考文献：
高效液相色谱法中流动相的配制方法 韩红兵
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