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NGS之外(一):MLPA技术检测拷贝数变异(CNV)

2021-05-27 16:41:00

前一阵子肿瘤圈内的一个大新闻:全球首个“广谱抗癌药”Keytruda获得FDA批准用于治疗“MSI-H/dMMR亚型”的实体瘤,让已经被二代测序仪(NGS)打压多年的一代测序仪着实又风光了一把,特别是ThermoFisher最新推出的SeqStudio基因分析仪也好好蹭了一把热度,风头盖过了他的前辈:3130、3730、3500这些经典型号。


SeqStudio基因分析仪采用独特的一体式盒式磁带,结合了毛细管阵列、聚合物储存器和阳极缓冲液,极大地简化了准备和实际操作时间。SeqStudio仪器占地面积小,内置电脑和集成触摸屏,使运行设置快速,直观和灵活。该系统允许Sanger测序和片段分析在同一板上运行,而无需更换任何消耗品。虽为4通道的小通量仪器,但运行时间快,非常适合医学检验所实验室,据说机器价格还不贵!

大多数人可能不会注意,我们通常说的一代测序仪的学名其实叫Genetic  Analyzer,它除了可以做我们常见的Sanger测序外(行业的金标准),还有一个重要的应用方向就是片段分析(Fragment Analysis),上面说的MSI检测就是其中之一,但我们今天不是要讲MSI,我们想介绍片段分析中另一个常见的应用方向---MLPA

MLPA技术的全称是MultiplexLigation-dependent ProbeAmplification。这项技术的最主要特点,是一次反应,就可以检测最多45个位点的基因拷贝数变异。而且这个方法检测拷贝数变异的准确率非常高。另外,MLPA技术还可以用于检测DNA的甲基化和SNP。今天我们主要讨论MLPA技术在检测基因拷贝数变异当中的应用。接下来,我们分两个方面来谈MLPA技术:MLPA的原理和相对于其它检测基因拷贝数变异方法MLPA技术的优缺点。


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MLPA工作原理

第1步,设计连接引物

每一个目标基因位点,设计一对引物。引物靠中间的部分,与目标序列互补。这一对引物,在基因组的目标位置上,是紧挨着的。因为是紧挨着的,未来可以方便地用连接酶把这一对引物连成一条DNA链。DNA连接酶对被连接的位点有很强的识别能力。如果DNA链之间不能很好地互补,连接反应就不会发生。MLPA技术,就是利用连接酶对连接位点的识别能力,来识别目标位点是否有序列变异。只有在顺序匹配的条件下,连接酶才能把两段DNA连在一起;如果有错配,就连接不上。在每对引物中,其中一个引物的外侧,加上一段无关的填充DNA序列。加上这段填充DNA序列的唯一目的,是让未来的连接产物,有不同的长度。以便于通过电泳,将不同长度的DNA片段给分离开来。引物最靠外侧的部分,是一对通用序列。未来,会用通用PCR扩增探针与这对通用序列互补,进行PCR扩增。一个反应当中,最多设计45个目标位点。长度靠近的两对引物之间,相差至少6到8个碱基的长度。在做毛细管电泳的时候,可以通过DNA片段的长度不同,来把不同的DNA片段给分离开。

第2步,准备通用的PCR荧光探针

针对引物外侧末端的通用序列,设计带荧光基团的PCR探针。

第3步,实验操作。

把连接引物和样品DNA混合,加热、退火,目的是让连接引物与目标DNA相结合。加入连接酶,进行连接反应。加入PCR荧光探针,和PCR酶,进行PCR反应。然后,把PCR产物用毛细管电泳进行电泳,检测带荧光的PCR扩增片段。

第4步,数据分析。

用软件,对电泳得到的峰的面积进行计算。再通过把样品与标准品的峰的面积进行比较,推算出目标基因位点的基因拷贝数。



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MLPA的技术优势

1、它一次可以检测最多45个位点的基因拷贝数变异,所以它的检测通量是比较高的。

2、它的检测仪器,是用毛细管电泳仪,也就是一代测序仪,所以,对于已经有一代测序仪的用户,它无需额外投入硬件设备。

3、它的检测稳定性是比较好的,它对拷贝数变异的检测结果的准确性是很高的。

4、它操作简单,在整个实验过程当中,包括连接反应、PCR反应,都是常规的分子生物学操作。对于绝大多数的分子生物学实验室,都可以轻松掌握。


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与其他检测CNV的方法相比较

1、与传统的荧光定量PCR相比

荧光定量PCR的一个反应只能检测一个位点,而MLPA方法一次可以检测多达45-51个位点,所以,MLPA技术相对于荧光定量PCR,在通量上有优势。

2、与FISH方法(原位荧光杂交)相比

FISH方法只能检测到大片段的拷贝数变异,对小片段的拷贝数变异不敏感。而MLPA方法可以检测到几十个碱基的小片段的拷贝数变异,所以MLPA方法的分辨率,相对于FISH方法有明显的优势。

3、比较MLPA方法和生物芯片方法,检测拷贝数变异。

生物芯片的通量更高,一次可以检测几万甚至几十万个点。但是生物芯片的操作复杂度更大,而且需要专门的芯片扫描仪,检测一个样本的成本也相对较高。


正是因为MLPA在检测拷贝数变异(CNV)特别是大片段缺失重复上的巨大优势,使得它可以作为NGS测序重要的补充和验证手段。

人类基因组上的变异主要分为三大类:

1、 单核苷酸变异,(通常称为单核苷酸多态性,通俗的说法就是单个DNA碱基的不同,简称SNP);

2、小的Indel(Insertion 和 Deletion的简写),指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除,其长度通常在50bp以下;

3、 大的结构性变异,这种类型比较多,包括长度在50bp以上的长片段序列的插入或者删除、染色体倒位、染色体内部或染色体之间的序列易位、拷贝数变异以及一些形式更为复杂的变异。

随着二代测序技术的快速发展,靶向富集高通量测序技术(基于杂交捕获或者多重PCR)得到了广泛的应用,可以非常高效的检测出SNP和小的Indel,但NGS也并不是万能的。比如靶向富集高通量测序有一个不足之处,就是它对于基因的拷贝数变异不敏感。原因是杂交捕获探针与目标DNA杂交时的杂交效率有很大的波动,而多重PCR扩增时的不同引物间的扩增效率也有很大的差别。正是这些波动和差别,会使目标区域测序得到的测序深度会有较大的波动。这样靶向富集测序得到的测序深度,不能很好地代表目标基因的拷贝数多少。虽然可以通过后期探针优化和分析方法改进来解决,但是到目前为止还是没有很好彻底解决这个缺陷。而MLPA技术能够很好地检测多个位点的基因拷贝数变异,所以MLPA技术作为靶向富集高通量测序的有力补充,得到了广泛的应用。


典型案例:BRCA1/2基因检测

随着安吉丽娜.朱莉事件,BRCA1/2基因检测逐渐被大家所认识和重视。BRCA1/2是乳腺癌易感基因,其胚系突变使得女性患乳腺癌的风险明显增加,CNV(拷贝数变异)占BRCA1/2突变类型的10%左右。不久前权威医学杂志《新英格兰医学杂志》发布重磅研究数据:BRCA1/2突变的晚期乳腺癌患者使用抗癌药奥拉帕尼比使用化疗效果好,副作用小,肿瘤进展或者死亡率降低42%。

这就使得无论是高危人群还是患者的检测需求大大增加,也使得基因检测公司鱼龙混杂。据了解,在开展BRCA1/2基因检测服务的基因检测公司或单位,大部分公司都是基于NGS平台开展的,且没有其他辅助手段。也就是说在某些情况下,可能会漏掉大片段拷贝数变异(CNV)的检出,而这一类型的突变占到所有可能突变的10%左右。消费者还是需要选择严谨、可靠的实验室来进行基因检测。



普瑞  

BRCA1/2基因检测  


誉衡基因——普瑞安(Pre-BRCA)-BRCA1/2基因检测

誉衡基因的普瑞安产品基于高通量测序平台,对 BRCA1/2 的全外显子进行胚系突变检测,外加MLPA技术辅助检测突变中可能出现的拷贝数变异,力争对BRCA1/2基因突变类型一网打尽,提供更为精准和全面的基因变异信息。通过对乳腺癌易感基因BRCA1/2的检测,以达到对潜在乳腺癌患者早期的筛查干预和精准用药指导的目的。

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