血清抗体检测方法﹑临床应用分析及质量控制方法

摘要：

目的 检测人血清相关抗体，鉴别生物学假阳性或既往感染病例，提出判断建议标准。

方法  用RPR法检测非特异性抗体及滴度；用TPPA法，IgM-ELISA法检测特异性抗体

结果  178例血清标本抗体RPR法阳性170人（95.5%），其中RPR滴度≤1：4者37人；滴度≥1:8者133人。TPPA法阳性者174人（97.75%）；IgM-ELISA法阳性者162人（162/178 ,91.01%）；在RPR滴度≦1:4时,TP-IgM-ELISA 法阳性者29人（6,23）；在RPR滴度≥1:8时TP-IgM-ELISA 法阳性者133人(37,49,34,13）。

结论  我们建议初诊（转诊）病人先检测RPR抗体（含滴度）和TPPA抗体；如两项为阴性，排除诊断；如TPPA法阳性，RPR滴度≥1:8且IgM-ELISA抗体阳性，病人有临床症状，即可诊断为现症病人。临床治疗4-6周后，只需复查RPR抗体和IgM-ELISA抗体是否转阴及RPR滴度下降程度。

关键词    抗体 TPPA IgM-ELISA 生物学假阳性

是由螺旋体感染而引起的一种性传播疾病，其主要传播方式为不洁性交，也可通过母婴传染，输血等其他间接方式传染。因此实验室检测螺旋体及患者血清中特异性抗体作为确认感染依据之一，并结合病史最终确诊是否现症感染或既往感染，是否需要治疗，检测的结果能否帮助临床鉴别存在于老年人生物学假阳性和自身免疫性疾病引起生物学假阳性。

检测方法学可分为病原学和血清学两类；病原学方法检测：为暗视野显微镜检查法，或镀银染色法，以镜下可找到螺旋体报告阳性结果；‚分子生物学方法PCR法。血清学方法检测：抗类脂质抗原的非特异性反应素(主要是IgG和IgM)，可用RPR，USR，TRUST和VDRL试验检测，用于筛查和疗效观察‚螺旋体特异性抗体（主要是IgG和IgM），用ELISA，TPPA，FTA-ABS，WB等方法检测，用于的确诊试验，不用于疗效观察。其中ELISA法可分别检测单独型别的IgG和IgM型抗体。

通常我们认为病原体检测即镜下找到螺旋体是特异性好，准确性高的方法，但此方法一般需在硬下疳期的生殖器溃疡部位组织液中找到，螺旋体入血后无法检测。同时PCR方法虽敏感性高，由于受到实验设备条件，技术经验，患者就诊时间及标本采集等因素影响，得到的阳性结果有时与临床不相符，限制了在实验室开展检查，多用于感染研究。血清学方法ELISA，TPPA，FTA-ABS，WB等试验，检测血清混合抗体（IgM、IgG），目前以TPPA，WB及FTA-ABS为实验室确诊试验。由于FTA-ABS和WB试验需要荧光显微镜，高质量试剂及严格实验室条件，不作为常规检测试验，多用于抗体研究检测和疑难病例检测。

目前医院系统用ELISA法或化学发光法（批量标本检测），皮肤病性病防治机构以TPPA法(单人份或批量)试验作为常规确诊试验。试验阳性才能考虑是否感染。但特异性抗体中的IgG型抗体在治疗后需要很长时间才能转阴，部分人群甚至终生阳性，所以TPPA等试验不能用于疗效观察。RPR等试验可作为筛选试验和用于疗效观察，非特异性抗体(非特异性反应素)在治疗后几周或数月可转阴。而IgM型抗体是机体感染螺旋体后出现最早的抗体，一般在感染15天后可检出，同时此抗体在规则治疗后很快转阴；IgM抗体可用于早期诊断及胎传的诊断（IgM抗体不易通过胎盘屏障），也可作为治疗疗效观察的新指标之一。

我们在临床上经常遇到患者TPPA/ELISA法检测特异性抗体阳性，RPR滴度从1:4~1:128不等；经规则治疗3--6个月后，患者血清抗体复检结果为RPR滴度下降了，但TPPA法或ELISA法试验检测的血清抗体仍是阳性，部分病人可能终身存在阳性。患者认为治疗无效，临床医生感到困惑，我们发现问题在于目前检测试剂检测的是螺旋体混合抗体，如果患者初诊时以ELISA法，TPPA法，RPR法及滴度检测抗体，同时增加TP-IgM抗体检测（我们称为初诊检验模式）；而治疗后复诊时检测TP-IgM抗体以及RPR滴度，这时避免了ELISA法和TPPA法（检测IgG型抗体）再次阳性结果的重复出现，这样的检验报告结果有利于临床观察疗效，同时与患者沟通容易一些（我们称为复诊检验模式）。

     我们用TPPA法，RPR及滴度试验，ELISA-TP-IgM法检测了2010年1月至2014年12月外院转诊及皮肤病门诊178例患者血清抗体，按照初诊检验模式和复诊检验模式进行检测，现报告如下。

1 资料及方法

1.1 资料   178例老年人为2010年1月至2014年12月外院病人及本院皮肤病门诊病人，其中男性94人，平均50.5岁；女性84人，平均47.3岁。20例正常人对照。

1.2 试剂及仪器   RPR试剂由上海科华生物工程公司生产；TPPA试剂由日本富士株式会社生产（珠海丽珠分装）；TP-IgM-ELISA试剂由德国欧蒙公司生产。RPR旋转仪，南京华东电子集团公司生产；BD680型酶标仪美国公司生产；XB100型洗板机，北京宏润达科技公司生产。

1.3方法   分别采集病人全血5ml,分离得到无溶血现象血清；RPR法，TPPA法和TP-IgM-ELISA法的操作严格按照试剂说明书进行。

1.4 结果判断：RPR法以出现凝集者为阳性，滴度试验以血清最高稀释倍数出现凝集报告稀释倍数；TPPA法以未致敏颗粒孔无凝集，致敏颗粒孔出现凝集为阳性。ELISA法用酶标仪在450nm波长读取的吸光度值（OD）；以血清标本OD／阴性对照OD≥2.1为标准，比值大于2.1者为抗体阳性。

1.5 统计学处理   采用卡方检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1    178例初诊患者实验室血清标本检测结果

        ①RPR法阳性170人（170/178,95.5%），RPR阴性8人(4例老年人4例婴幼儿)；其中RPR滴度≤1：4者37(2,9,26；37/178；20.79%)人；滴度≥1:8 者133人(37,49,34,13；133/178,74.72%)。

        ②TPPA法阳性者174人（174/178,97.75%）。阴性者4人（4例老年人）。

         ③TP-IgM-ELISA法阳性者162人（162/178 ,91.01%）；在RPR滴度≦1:4时,TP-IgM-ELISA 法阳性者29人（6,23）；在RPR滴度≥1:8时TP-IgM-ELISA 法阳性者133人(37,49,34,13）。

       ④12（12/178）例老年患者中， 8例TPPA阳性，其中4例RPR阳性，RPR滴度≤1:4；4例RPR阴性；TP-IgM-ELISA试验均阴性。4例TPPA法阴性，RPR阳性，RPR滴度≤1:4，TP-IgM-ELISA试验均阴性 。    

        ⑤8（8/178）例婴幼儿患者中4例RPR法，TPPA法,TP-IgM-ELISA法均阳性，RPR滴度≥1:8。4例仅TPPA法阳性；RPR法,TP-IgM-ELISA法阴性。

       ⑥经治疗6个月后，178例患者中失访11人。167例成功复诊患者中，RPR法阳性46人（46/167,27.54%），TPPA法167人阳性(167/167,100%)，TP-IgM-ELISA法阳性者27人(27/167,16.17%)。

2.2    178例患者临床诊断结果

    ①TP-IgM-ELISA法阳性者162例（含婴幼儿4人），结合TPPA，RPR滴度结果和临床资料，诊断为现症感染。

   ②12例老年患者的TP-IgM-ELISA试验均阴性，有8例TPPA法阳性，但RPR阴性或滴度≤1:4；另4例TPPA法阴性。结合临床资料，12例均诊断为既往感染或生物学假阳性。

    ③8例婴幼儿患者中4例RPR法，TPPA法,TP-IgM-ELISA法均阳性，RPR滴度≥1:8，最高到1:128,结合临床资料及其父母血清抗体结果，1例诊断为现症感染；3例为胎传。另4例仅 TPPA法阳性；而RPR法,TP-IgM-ELISA法阴性，结合临床资料排除。

2.3   178例标本 血清抗体阳性见表1

2.4   167例（复诊中失访11人）治疗6个月后复诊病人血清抗体检测阳性见表2

2.5   8例婴幼儿血清抗体检测结果见表3

2.6   检测诊断建议标准见表4

3讨论

3.1  根据传染方式不同可分为获得（后天）和胎传（先天）。根据病程可分为早期（分为一期和二期）和晚期（又称三期），此外还有潜伏（隐性）。早期传染性大，破坏性小，经足量规则治疗可治愈；晚期传染性小，虽经治疗只能减轻机体破坏程度而难以纠正器质性损害。螺旋体感染机体后免疫系统会产生两类相关抗体：一类是抗类脂质抗原的非特异性反应素(主要是IgG和IgM)（又称非特异性抗体）可用RPR，USR，TRUST和VDRL试验检测，作为筛选试验和疗效观察，非特异性抗体在治疗后几周或数月可转阴；另一类是特异性抗体(IgG，IgM)，可用ELISA，TPPA，FTA-ABS，WB等方法检测[1]。

  3.2  由于生物学假阳性的存在（部分老年人有基础病或自身免疫性疾病产生自身抗体），我们观察到12（12/178）例老年患者虽RPR试验阳性，TPPA阳性，但IgM-ELISA试验阴性，RPR滴度≤1:4，结合临床资料病人否认有不洁性交史或输血史等，均诊断为原因不明既往感染或生物学假阳性[2]。

  3.3 TPPA/IgM-ELISA试验均阳性的162例患者中，RPR滴度≥1:4，结合临床资料后均诊断为现症病人（一期或二期）。在经规则治疗6个月后，167例复诊患者（失访11例）中，TPPA阳性患者167人；121例患者RPR试验和140例患者IgM-ELISA抗体试验由阳性转为阴性。说明尽早检测，规则治疗，对于患者康复有指导意义。16例患者IgM-ELISA试验仍为阳性，我们分析是否为疗程不足或再感染原因引起不能排除，建议临床进行第二次规则治疗，同时待治疗完成后行血清抗体的复检。根据复检结果并结合临床症状判断患者治疗效果。由表2中RPR阳性人数及滴度分布情况看与初诊比较均有下降；RPR仍为阳性的有46人，但RPR滴度较治疗前明显下降，此类患者仍需复诊观察一年以上，如随访中发现RPR滴度维持在1:4左右或以下，在排除再感染，神经，心血管等后，考虑为血清固定[3]，一般不需再次治疗。

3.4  8例婴幼儿血清抗体结果见表3，由免疫学抗体产生的规律可知IgM型抗体是机体感染螺旋体后出现最早的抗体，IgM抗体不易通过胎盘屏障，一般在感染15天后可检出，婴幼儿血清抗体阳性表示有宫内感染。有4例婴幼儿血清TPPA抗体阳性，RPR阳性且滴度≥1：8，TP-IgM抗体阳性，经结合其父母血清抗体结果及临床资料，临床诊断为胎传3例和现症1例（8岁女孩，经临床资料分析考虑感染途径为与其母密切接触相关）。而IgG抗体可通过胎盘屏障进入婴幼儿血液中，该类抗体转阴的时间一般很长，因此我们观察到另外4例婴幼儿血清抗体仅TPPA抗体阳性，其他抗体试验阴性，经结合其父母血清抗体结果，排除了。我们的检测说明对于婴幼儿血清抗体检测及临床解读需谨慎，需结合其父母血清抗体情况来判断。我们通过检测TP-IgM抗体和RPR及滴度可排除大部分婴幼儿诊断。这一点在其它医院转诊到我院皮肤科门诊后最终确诊或排除的诊断情况来看，主要依靠实验室检测结果和临床症状。

3.5  我们观察到在成功复诊的167例患者中TPPA仍为阳性与文献报道的一致；我们的检测结果表明IgM抗体转阴的例数与初诊的例数比较差异有统计学意义。TP-IgM抗体在治疗后4周至8周即开始转阴，是治疗疗效观察的新指标之一，再结合RPR滴度下降的程度，能给临床医生诊断治疗提供更加有效的血清学依据，与国内学者报道的相似[4]。

     3.6 我们在检测诊断中体会到血清试验项目名称多，只有合理应用才能避免混淆。建议初诊（转诊）病人先检测RPR（含滴度）和TPPA法抗体。如果两项为阴性，结合临床资料可排除诊断。如果RPR和TPPA法抗体两项阳性，但RPR滴度≤1:4，此时增加检测IgM-ELISA抗体，如果为阴性，同时结合临床资料，考虑为既往感染可能性大。如果IgM-ELISA抗体阳性且RPR滴度≥1:8，病人有临床症状，即可诊断为现症病人，具有传染性。在临床规则治疗4到6个月后，只需复查RPR滴度和IgM-ELISA法IgM抗体是否转阴并观察RPR滴度下降程度来观察评价疗效；这样就能避免实验室检验结果与临床医生解释不一致引起病人恐惧心理和抗生素滥用引起耐药问题；尤其是老年人特异性抗体阳性结果时对检验结果的解释需特别严谨，对老年人抗生素的使用要慎重[5]。

  3.7 质量控制体会   我们在检测工作中发现外院转诊患者抗体检测方法多数是ELISA法，而我院使用TPPA法重新确认复查后，有时它们结果不一致，我们观察到ELISA法抗体阳性例数多一些，分析认为是由于抗体试验检测方法原理不同而引起，尤其是ELISA法检测结果处在灰区时报告弱阳性病人时，两试验结果差别更明显；我们在多年的检测实践中体会到使用TPPA法的特异性优于ELISA法。我们知道ELISA法影响因素较多，有血清标本溶血，细菌污染，反复冻融等原因；也有试验操作过程中出现的问题，加样不准，温育温度时间过长过短，洗板不充分等；有学者认为与试剂包被的抗原（螺旋体）为基因表达产物有关，部分非螺旋体感染人体产生的抗体此试剂也可出现阳性结果。而TPPA法试剂中包含了可清除非特异性抗体组分，因此其检测结果与FTA-ABS和WB试验结果相关性高。同时试验又不需特别昂贵的设备，判断结果只需严格按照试剂盒提供的凝集图谱，即可得到正确结果。该试验在皮肤病防治机构使用相当普遍，适用于基层机构开展检测与性病防治。同时我们检测时高度关注试验中可能出现的抗原抗体比例不合适引起的带现象，一般可通过血清稀释的办法来避免。

   3.8质量控制体会   TPPA法检测抗体是在U型板上进行的凝集试验，每个标本需4个U型孔，标本经稀释后，在第3孔加非致敏颗粒（等同于试剂对照），第4孔加致敏颗粒（包被特异性蛋白），我的理解是每个标本都有试剂对照，可以排除血清中非螺旋体抗体的干扰或试剂保存不当等引起的检测质量问题。判断结果时应严格与试剂盒配置的阳性阴性标准凝集图谱比对。在遇到致敏颗粒孔与非致敏颗粒孔均出现凝集，此时必须用试剂中的干粉溶解稀释液按说明书将血清标本进行吸附操作后，重新检测，最终得出正确结果。当检测结果处在灰区时如何报告？我们的处理方法是联系临床医生，了解病人的病史后可报告为阴性，并建议病人随诊复查，如果复检时发现抗体有阳性进展，尽快报告临床医生。

    3.9质量控制体会   TP-ELISA-IgM试验方法虽属于酶联法，但与常规ELISA的检测不同之处是检测时首先 第一步将血清与专用吸附剂试剂按1:10的比例室温中反应10分钟后，3000转/分离心5分钟，使得血清中IgG类抗体及其它非特异性抗体产生沉淀，检测时吸取上清液，这样处理后IgM抗体检测的特异性进一步提高了。

 3.10 学习临床知识体会  通过与临床医生的沟通，我认为检验技师掌握临床常识对检验结果的合理解释有帮助。对于存在的生物学假阴性和假阳性问题，如病人患有自身免疫病，肿瘤，糖尿病，及病毒感染者，结核病，麻风病等慢性感染性疾病均有可能导致检测假阳性，尤其是孕妇和老年人；这类病人血清出现的假阳性结果以RPR法阳性多见，其滴度不高，常在1：4--1:8之间，但特异性抗体试验阴性。终上所述RPR法的阳性反应并非特有；TPPA法或ELISA法的阳性反应，仅表示检测到了患者血清存在抗体，是否为病人必须结合临床资料综合判断。TP-IgM抗体检测对某些特殊人群诊断有重要鉴别作用，可作为临床诊断，评价治疗疗效，观察再感染的新指标之一。

参考文献

1. 李志文，叶顺章，于淞.现代性传播疾病【M】北京：人民卫生出版社，2010：86-92

2.石贺芹.老年人抗体阳性诊断易误诊原因浅析【J】中国实用医药，2016，        23（8）：78-79

3.李保强，朱彦明，陆洁.血清学假阳性疾病分析及与的对比【J】.中国皮肤  性病学杂志，2013,23（5）：298-299【J】

 4.曾霓，曹碧兰.血清学检测方法研究和应用进展【J】.中国皮肤性病学杂志，2014（5）：530-533

5.郭伟，孙静.老年人抗螺旋体抗体阳性的临床分析及防治对策【J】.检验医学与临床，2013 ，10（5）：349-350

作者：吕新民 主任技师210042 南京市职业病防治院皮肤病防治所检验科

      江苏大学医学院医学检验本科毕业，主要从事免疫学检测。

      Tel:13601469499

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