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编者语：我们微信公众号发布了多篇案例揭秘文章，受到同行的关注。闲暇时间回头看看这些同行辛勤的翻译作品，每次都有新的感受。今天给大家介绍一下拉曼光谱的实际应用案例。文章出处见下面截图。期望本文能对你有所启示。建议大家在电脑版微信仔细阅读本文。
使用拉曼光谱技术无损并且快速地同时测定 复方制剂中的对乙酰氨基酚和尼美舒利
GargiR. Lakhwani, O. D. Sherikar, and Priti J. Mehta
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摘要
一种快速、无损的拉曼光谱法得以开发，用于定量测定复方制剂中的扑热息痛和尼美舒利。本文通过测量对乙酰氨基酚和尼美舒利在853cm-1和1336cm-1处的峰值强度，开发了拉曼单变量校准模型。所开发的方法成功应用于扑热息痛和尼美舒利复方制剂中扑热息痛和尼美舒利的原位分析和同时定量测定，且方法是根据在ICH指导原则进行验证。因此，开发的拉曼光谱法可用于同时估算其组合剂型中的对乙酰氨基酚和尼美舒利作为制药工业用于常规质量控制的过程分析技术工具。
关键词：原位分析，尼美舒利，非破坏性的，对乙酰氨基酚，拉曼光谱
药物发现和药物开发方法的发展导致在药物市场上增加了大量较新的药物。随着绿色化学的出现，新颖的环保分析方法得到了重视。从环境以及操作人员的安全方面考虑，药物制剂的定性和定量分析对开发快速，可靠和无损环保技术存在巨大需求。由于以下主要优点：简单，经济和节省时间，无损测定技术得到了应用，因为它不涉及任何种类的样品制备。这不涉及任何有机和无机溶剂，所以这些也是环保的。激光拉曼光谱已经被证明是一种优秀的非破坏性的绿色分析化学工具，不仅用于定性目的，而且用于定量分析[1,2,3,4,5]。
拉曼光谱法是无损和无溶剂的技术。借助拉曼技术，可以通过塑料袋，玻璃小瓶和水溶液分析样品。它需要非常少量的样品，分析所需时间只有几秒到几分钟。尽管事实上拉曼光谱具有如此多的优点，但是当该技术被发现时，并没有达到原来的预期。背后的最重要的原因是仪器的不足，拉曼分析仪器系统的成本很高，拉曼分析仪器系统的分辨率和信噪比很高，以及不能排除或消除的荧光等。然而，随着精密的仪器仪表的使用，如带有傅立叶变换拉曼的近红外激光器，引入光纤和化学计量学的可用性来协助分析数据，最近拉曼分析技术在各个制药领域的应用数量不断提高，不久之后，随着拉曼的应用研究逐渐深入，它将成为质量控制武器库的组成部分[5]。
拉曼光谱在分析活性药物成分（API）含量超过10％[1,2,3,4,5,6,7]的产品时是一个特别有用的工具，但有时API含量为2-5％时也被采用 [8,9]。相比之下，含有芳族基团的API比肪族具有更强的拉曼信号。在良好的情况下，甚至可以使用该方法对API含量低于0.1％（w/ w）水平进行可靠的定量分析[10]。此外;拉曼技术还可以量化多组分药物制剂[11,12]。
对乙酰氨基酚（PCM）化学名称是N-（4-羟基苯基）-乙酰胺。它是一种中枢和外周作用的非阿片类镇痛药和解热药，广泛应用于非处方镇痛药。尼美舒利（NIM）是一种抗炎药物，化学名称为N-（4-硝基-2-苯氧基苯基）-甲磺酰胺。它被批准用于治疗肌肉骨骼疾病，痛经，血栓性静脉炎和牙痛，炎症。它们的复方制剂由于其协同效应，较长的作用时间，在印度广泛用于的肌肉骨骼疾病。已经报道了同时测定两者的多种技术，如紫外可见分光光度法（UV/ Vis）[13,14]，高效液相色谱法（HPLC）[15,16,17]和高性能薄液相色谱法[18]。
由美国食品药品监督管理局（FDA）提出的过程分析技术（PAT），将提供有关创新药物开发，设计和制造控制以及评估关键质量和性能属性的信息，从而确保药品质量。当用于药品开发和放大工作时，拉曼光谱有为过程理解，优化和监控提供宝贵意见的潜力。在诸如湿法制粒和批量结晶时，它被用于来量化原位变化。定量和定性趋势可以进行评估，并且可以在基于拉曼分析的常规处理中快速进行调整[5]。
除了拉曼光谱法以外，所有上述讨论的技术都是耗时的，破坏性的，需要繁琐冗长的样品制备，这在过程分析中不易使用。因此，我们的目标是开发一种快速，非破坏性和原位分析技术，用于同时估算其复方制剂中的对乙酰氨基酚和尼美舒利，这可以被制药行业轻松地用于常规在线或在线分析。
材料和方法
对乙酰氨基酚是从印度孟买S.D. Fine Chemicals Ltd.处获得，尼美舒利由印度古吉拉特Bhat的Torrent研究中心友情提供。辅料如乳糖，羟丙基甲基纤维素（HPMC），微晶纤维素（MCC），蔗糖，，新德里，印度）。甲醇使用HPLC级（S.D.Fine Chemicals Ltd.，Mumbai，India）。
不同品牌的片剂从当地药店采购，如Dolamide Tablets（RanbaxyLtd.，India）；ArtifenTablets (Aglowmed Pharmaceuticals ltd., India); Nimek Para Tablets (J.B.Chemicals Ltd., India)和 Biogesic Plus Tablets(Biochem, India)标签要求含有对乙酰氨基酚500mg（71.4%）和尼美舒利100mg（14.3%w/w）；SurgimidePlus Tablets (Focus Healthcare, India) 标签要求含有对乙酰氨基酚325mg（46.4%w/w）和尼美舒利100mg（14.3%w/w）。
拉曼光谱仪：
使用完全集成的台式分散R-3000拉曼分光光度计（RamanSystems Inc.，USA），其由装有电荷耦合器件检测器的二极管激光光学取样探头组成。实验期间使用的激光激发波长为785nm，探头配有固体和液体的特殊聚焦罩。所有光谱以约250mW的激光功率以光谱分辨率4cm-1记录，并以180°的角度收集散射光。
仪器使用由特氟龙涂层组成的验证探针进行校准。使用RSI扫描软件自动进行数据收集和传输。
高效液相仪器和色谱条件：
用于HPLC分析的PU-2080加智能泵（日本Jasco公司）和体积注射量为20μL的Rheodyne注射器。通过MD-2015plus多波长检测器进行检测，其工作波长为276nm。使用BorwinPDA软件记录色谱峰。色谱柱为5μm粒径的Luna，PhenomenexC-18柱（150×4.6mm）。拟使用的流动相和其他条件为已经报道的[16]。流速为1ml/ min，流动相通过Millipore公司的0.45μm孔膜过滤器过滤脱气。
拉曼光谱测量条件：
于研钵中研磨样品10分钟以制备混合均匀的粉末。从低密度聚乙烯袋中取100mg粉末并将其铺展形成均匀厚度的粉末层来记录所有样品的光谱。对乙酰氨基酚测量波数为853cm-1，尼美舒利为1336cm-1。每个拉曼光谱对应于每次扫描的曝光时间为5s/次的4次扫描的累积，总积分时间累积为20秒。考虑到异质性，对每个样品进行了5次测量;所呈现的光谱是所有记录光谱的平均值。如果片剂的泡罩包装没有颜色，则可以在水平方向上直接用探针进行分析，没有任何样品制备过程，且在初级包装材料中直接测定。如果泡罩包装着色，则需要从初级包装材料中取出片剂，然后进行分析。
方法验证：
根据ICH指导原则[19,20]进行方法验证。
线性：以不同含量比制备PCM和NIM的混合标准样品，保持粉末混合物的总重量为700mg，使用滑石粉调节重量。对于PCM的线性，采用恒定的100mgNIM（14.29％w/w），PCM分别为100mg（14.29％w/w），200mg（28.57％w/w），300mg（42.85％w/w），400mg（57.14％w/w），500mg（71.43％w/w）至600mg（85.71％w/w）。对于NIM的线性，采用恒定的500mgPCM（71.43%w/w），NIM分别为50mg（7.07%w/w），75mg （10.71%w/w），100mg （14.28%w/w），125 mg （17.86% w/w），150 mg（21.35%w/w），175mg （25.00%w/w）到200 mg （28.57% w/w）。
精密度：批内和批间精密度通过测量PCM和NIM的三种浓度水平的拉曼计数确定，PCM的水平为200，400，600mg（28.57，57.14，85.71%w/w），NIM的水平为50，100，150mg（7.43，14.29，21.43%w/w），使用滑石粉将重量控制在700mg。通过六次测定含有500mgPCM（71.4％w/ w）和NIM100mg（14.3％w/ w）的混合物来测定重复性。
准确性：通过加入标准药物至相当于250mg PCM和50mgNIM的片剂粉末，以三种不同浓度水平80,100和120％一式三份进行回收率研究。
耐用性：通过变化拉曼光谱±10％的积分时间，帧尺寸和功率强度来记录光谱，以进行耐用性研究。
结果与讨论：拉曼射线的强度取决于许多因素，包括入射激光功率，散射辐射的频率，散射中涉及的材料的吸收率和检测系统的响应。最常用的赋形剂如乳糖，羟丙甲基纤维素，微晶纤维素，蔗糖，硬脂酸镁和滑石的拉曼光谱均有记录。除滑石粉以外所有赋形剂在激光（785nm）的激发波长处没有任何拉曼散射和荧光，，但滑石在295cm-1和1092cm-1处具有两个拉曼峰。选择滑石作为稀释剂，以便在PCM和NIM的测定拉曼位移检查滑石的干扰（如果有的话）。
记录PCM和NIM的拉曼光谱，如图1所示。显然，最强振动的853cm-1和1336cm-1应该分别用于PCM和NIM定量分析。PCM可以在853cm-1测量，没有来自NIM和滑石的任何干扰。对于NIM的定量测定，选择1336cm-1作为测量波数，但PCM显示1336cm -1处的拉曼位移，其干扰并且在NIM的测定中引入误差。观察到PCM在1336cm-1和853cm-1处的拉曼计数比为0.67。通过从1336cm-1的总计数中扣除PCM的拉曼计数，可以获得NIM的拉曼计数，可用于PCM存在时的NIM测定。
图1对乙酰氨基酚和尼美舒利单独的拉曼光谱
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固体粉末混合物的拉曼定量分析通常是复杂的，因为拉曼强度取决于一些因素的重现性，如颗粒尺寸，样品的包装密度，混合物的均匀性和检测器响应的变化。为了评估这些变化，将所有样品研磨10分钟。从整个混合物的子样品中获得各种光谱，并将激光束随机定位在样品上，使得拉曼计数中没有产生任何显着差异。整合时间和帧大小分别优化为20秒和5秒;以获得信号与噪声水平之间以及样品暴露于激光束的时间的平衡。激光功率强度优化为250mW;因为功率更低时，拉曼计数受阻；功率更高时，荧光发生率高。
开发的拉曼光谱法基于简单的线性回归模型。通过分析不同浓度的两种药物来评估PCM和NIM的线性。在本研究中，选择了6种浓度，PCM为100〜600mg（14.28-85.71％w/ w），NIM为50-200mg（7.07-28.56％w/ w）（图2和图3）。
图2对乙酰氨基酚和尼美舒利组合的拉曼光谱
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备注：尼美舒利恒定（100mg）对乙酰氨基酚（100-600mg）的拉曼光谱。
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图3对乙酰氨基酚和尼美舒利组合的拉曼光谱
备注：对乙酰氨基酚恒量（500mg）与尼美舒利（50-200mg）的拉曼光谱。
对应于药物分子的拉曼峰的强度显示出光谱中的浓度依赖性变化。从每个混合样品记录六个拉曼光谱，绘制强度对浓度的曲线图，得到线性方程，IPCM=0.767CPCM+59.62...（1）和INIM=8.05CNIM-125.3...（2）。PCM和NIM的相关系数分别为0.998和0.992。
报告方法的准确性是根据市售的片剂制剂中PCM和NIM的回收率估算的，并列于表1和表2中。发现批内，批间精密度和重复性的相对标准偏差值百分值小于2，这表明开发的方法对于PCM和NIM的同时测定是精确的。
表格1 PCM准确性研究
水平（%） | 标准浓度 （mg） | 加入量 （mg） | 总量 （mg） | 回收量 （mg） | 回收平均值%±SD |
80 | 250 | 200 | 450 | 444.65 | 98.79±0.46 |
| 250 | 200 | 450 | 442.45 |
|
| 250 | 200 | 450 | 446.56 |
|
100 | 250 | 250 | 500 | 496.64 | 98.77±0.64 |
| 250 | 250 | 500 | 490.40 |
|
| 250 | 250 | 500 | 494.49 |
|
120 | 250 | 300 | 550 | 548.24 | 98.94±0.65 |
| 250 | 300 | 550 | 542.72 |
|
| 250 | 300 | 550 | 541.54 |
|
表格2 NIM准确性研究
水平（%） | 标准浓度 （mg） | 加入量 （mg） | 总量 （mg） | 回收量 （mg） | 回收平均值%±SD |
80 | 50 | 40 | 90 | 88.94 | 98.45±2.194 |
| 50 | 40 | 90 | 90.39 |
|
| 50 | 40 | 90 | 86.48 |
|
100 | 50 | 50 | 100 | 99.43 | 99.03±0.350 |
| 50 | 50 | 100 | 98.80 |
|
| 50 | 50 | 100 | 98.85 |
|
120 | 50 | 60 | 110 | 109.48 | 99.60±0.095 |
| 50 | 60 | 110 | 109.67 |
|
| 50 | 60 | 110 | 109.52 |
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通过改变帧尺寸±1秒和积分时间±5秒报告方法的耐用性，所有结果均在所得到的片剂测定值的±2％以内。所有验证参数总结在表3中。
表格3开发拉曼光谱技术方法的验证参数概要
参数 | PCM | NIM |
线性（%w/w） | 14.28~85.71 | 7.07~28.56 |
R2 | 0.998 | 0.991 |
线性回归方程 | y=0.767x+59.62 | y=8.050x-125.3 |
检测限LOD（%w/w） | 2.77 | 0.37 |
定量限LOQ（%w/w） | 8.38 | 1.11 |
重复性（%RSD） | 1.19~2.34 | 1.28~2.07 |
批内差异性（%RSD） | 0.2~2.03 | 0.89~1.60 |
批间差异性（%RSD） | 1.45~2.23 | 0.46~1.06 |
回收率% | 98.77~98.94 | 98.45~99.60 |
开发的方法是使用PCM和NIM的API开发和验证的;因此应用完整片剂的方法，必须检查片剂的包装密度和厚度对两种药物的拉曼位移的影响。同样的，记录完整片剂和粉碎的片剂粉末的拉曼光谱，并显示在图4中。图中表明，填充密度或材料的厚度对在他们的完整片剂剂型时分析测定PCM和NIM的拉曼位移没有影响。开发的方法应用测定其销售的复方片剂中PCM和NIM的量得到评估。采用无色泡罩包装的两种PCM和NIM复方制剂，其片剂可以原位分析，非接触形式，无需从主包装系统中除去片剂，可以在其包装材料中以其定量测量复方制剂中的PCM和NIM。三种剂型采用彩色泡罩包装，需要从其初级包装中除去片剂以进行分析，因为着色的泡罩包装引起拉曼散射骤冷，而导致峰值强度降低。PCM和NIM可以在复方制剂中以多种不同重量比存在，如500mg：100mg或者325mg：100mg。因此，为了更广泛的适用性，将开发的方法应用于具有不同重量比的PCM和NIM的各种品牌的市售配方。不同市场配方的测定结果总结在表4中。
图4完整片剂的以及粉碎的片剂粉末的拉曼光谱
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表格4各种市售复方PCM-NIM片剂的拉曼方法的结果
市售 产品 | 标示量 | 测量值%±SD |
PCM | NIM | PCM | NIM |
A | 500mg | 100mg | 99.90±3.058 | 98.76±0.626 |
B | 98.19±1.791 | 99.52±0.773 |
C | 99.11±1.265 | 99.30±0.724 |
D | 325mg | 100mg | 102.73±1.973 | 97.65±0.993 |
E | 100.22±1.805 | 99.00±1.137 |
将用拉曼光谱技术获得的市售制剂的测定结果与报道的反相高效液相方法（RP-HLPC）[16]进行比较，使用Student配对t检验，置信水平为0.05。t-cal值小于t-tab值，显着性水平为99.95％。该结果表明两种方法均具有良好的一致性，并且通过拉曼光谱法和报道的反相高效液相方法获得的测定结果没有显着差异。
开发了一种简单，快速，无损和无溶剂的拉曼光谱技术，用于同时测定PCM和NIM复方制剂中PCM和NIM的量。使用开发的拉曼法可以通过其无色初级包装材料直接分析片剂；因此，它作为过程分析技术（PAT）工具适用于制药行业常规质量控制检查中的实时和在线分析是一种有前途的技术。此外，拉曼光谱法在绿色分析化学的方法库中应用越来越广泛。
脚注
Lakhwani，等：应用拉曼光谱技术测定对乙酰氨基酚和尼美舒利。
文章信息
Indian J Pharm Sci. 2013Mar-Apr; 75(2): 211–216.
PMCID: PMC3757861
Gargi R. Lakhwani, O. D. Sherikar, and Priti J. Mehta*
尼尔玛大学药学研究所药物分析系Sarkhej-GandhinagarHighway，Ahmedabad-382 481，印度
通讯地址：E-mail：ni.ca.inuamrin@athemitirprd
收到2012年3月1日；2013年2月21日修订；接受2013年3月5日。
版权所有：印度药学杂志
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印度医药科学杂志的文章由Medknow出版社提供
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