选自中华检验医学杂志, 2015,38(10)
分子诊断技术在临床实验室中的应用比例越来越高，尤其是以聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)核酸扩增技术为基础的DNA/RNA分子诊断方法已逐渐成为疾病的临床诊断"金标准"。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前临床使用最多的是实时荧光PCR试剂[1]。国际学术界为了确保实时荧光定量PCR实验检测的质量，已有最低要求试验信息量(The Minimum Information for Publication of Quantitative Real–Time PCR Experiments, MIQE)等标准，对样本处理、实验设计、体系设置及质量控制等提出了明确的要求[2]。基于核酸扩增(PCR)技术，笔者阐述检测试剂的开发、生产及应用中体系设置的具体要求。
一、基于核酸扩增的体外诊断方法和检测试剂的现状
PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大特点是实现了体外大规模复制DNA片段[3]。PCR方法由美国科学家Kary B．Mullis教授建立，1993年Mullis教授因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖。1995年美国科学家在PCR (Perkin Elmer，PE)基础上发展起来一种新的核酸定量技术，即实时PCR (Real time PCR，RT–PCR)又称荧光定量PCR[4]。该技术在常规PCR基础上运用荧光标记探针，实时检测PCR产物，实现DNA定量分析[5]。
PCR技术利用与靶核酸序列两端互补的寡核苷酸引物经过30～50个循环扩增将靶核酸放大数百万倍，从而达到检测靶核酸的目的。根据核酸扩增类检测试剂在临床上的不同应用，可分为感染疾病、遗传疾病及其他疾病三个大类，具体可细分为肝炎类、性病/优生优育类、宫颈癌类、消化类、遗传类、呼吸道类、肿瘤和个体化用药类、心脑血管类、耳聋类、院感类及肾病类等十几个小类。目前我国临床上PCR类诊断技术占体外诊断市场比例仅为10%左右，距欧美等发达国家差距较大，但每年以超过20%的速度迅速增长。
二、PCR试剂体系设置的基本要求
PCR技术已广泛地运用于分子生物学和临床诊断的各个领域，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是讨论的重点[6]。
(一)PCR引物设计
PCR引物设计非常关键，直接关系到体系扩增效率的高低[7]。引物质量、浓度及两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、荧光信号低的常见原因。可选用如下应对策略：(1)选定一个质量控制较好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看光密度(optical density，OD)值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两条引物带的亮度应大体一致，如果一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败。如果一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
(二)探针设计
目前作为商业用途的探针主要有Taqman探针(或称水解探针)、分子信标探针、Scorpions探针及荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer, FRET)探针[8]。临床核酸扩增检测试剂使用最多的是Taqman探针，分子信标探针特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列[9]。
探针设计首先需要根据不同的检测要求来选择合适的荧光材料，这影响实时PCR敏感性，也是最为关键的环节[10]。Taqman探针用于Taqman分析法，它能被DNA聚合酶(例如Taq酶)的5'→3'活性所降解。
(三)PCR反应液体系设置
PCR反应液体系包括促成PCR反应启动的基本要素：酶、引物探针、模板、酶缓冲液、dNTP、镁离子，一个良好的PCR扩增反应液可使引物探针的扩增效率达到95%以上，同时为了使扩增达到最佳水平，也会经常使用一些添加剂或稳定剂。如何进行PCR反应液的体系设置，根据扩增类检测试剂的临床应用情况分析，需要注意以下方面的优化。
1．选择合适的反应液体积：
通常进行PCR扩增采用的体积为20 μl、30 μl、50 μl或100 μl，使用多少体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定。临床上，如果进行低浓度模板扩增，需要提高检测灵敏度时，建议使用大体积，推荐使用40～100μl之间的体积，体积越大，允许使用的模板体积也可放大，灵敏度随之提升。理论上讲，大体积的稳定性更好，实验的重现性也更好。
2．MgCl2的浓度：
在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶活性的发挥至关重要，不仅如此，适当的MgCl2浓度还能在反应中得到较低的阈值循环数(threshold cycle，Ct)值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以，对其的浓度的选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2～5 mmol/L浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT–PCR而言，则应选择的浓度为4～8 mmol/L。但是，过高的MgCl2浓度会引起非特异性扩增，影响最后的产物纯度。因此，需要对不同的体系进行单独的优化，得到最合适的浓度。
3．其他离子浓度：
NH4+和K＋都会影响PCR，增加K＋的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的保真性，NH4+也有相同的作用。当阳离子浓度(Kcl>0.2 mol/L)过高时，DNA在94 ℃根本不会发生变性，从而导致PCR反应失败。
4．DNA聚合酶的选择：
自然界的核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。PCR技术不但能对DNA进行有效扩增还可以对RNA进行扩增，两者不同之处在于，对于RNA的扩增首先需要通过引物和逆转录酶的作用，使目标RNA先转化为cDNA，然后再按照扩增DNA的方法进行复制即可。
对于RNA来讲，逆转录为cDNA是RNA成功扩增的关键，一般的逆转录酶具有以下特性：(1)DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的能力。此功能需要以RNA为引物，在引物tRNA3'–末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。(2)核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)H活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5'端水解掉RNA分子。(3)DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第1条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第2条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。不同的逆转录酶以上各种活性效率不等，针对不同的目标RNA，需要筛选合适的逆转录酶。
PCR反应中DNA聚合酶的选择，对于实验的准确性、稳定性、灵敏度与特异性等性能均至关重要。PCR聚合酶选择根据实验者的需求主要从扩增的效率和保真性这两个方面来考虑。实际上用于PCR反应的耐热DNA聚合酶可分为3类：(1)第一类：扩增效率高，但没有校正活性。该类聚合酶具有很强的从5'→3'方向合成DNA功能，但没有从3'→5'方向外切酶的活性。该类酶的代表就是常用的普通Taq酶，预先加入抗体的所谓热启动Taq酶也属于此类。该类酶合成效率高，但合成过程中出现的错配不能被有效纠正。(2)第二类：既具有5'→3'方向合成DNA的功能，又具有3'→5'方向外切酶的活性具备校正活性，但DNA合成效率与普通Taq酶相比大大降低。(3)第三类：高保真高效率DNA聚合酶[如，PfuDNA聚合酶(Pfu DNA polymerase)等]，兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq酶与高保真聚合酶按一定比例混合即可(如Taq Plus)，已为较多采用，但混合后由于二者对底物模板存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果。
5．dNTP浓度：
PCR反应中每种dNTP的终浓度为50～200 μmol/L，在此范围内，扩增产物量、特异性与合成保真性之间的平衡最佳，dNTP浓度过低将影响扩增产量，过高则会导致错误掺入。由于dNTP的量还受其他因素的影响，所以不同反应体系中dNTP的最佳浓度不尽相同，但其浓度不能低于10～15 μmol/L。
6．模板的选择：
PCR反应用DNA(单、双链DNA)或RNA都可以作模板进行核酸的体外扩增。若起始材料是RNA，须先通过逆转录，得到cDNA后才能进行正常PCR扩增。具体核酸标本来源在后续核酸提取中会具体再讲，在此不再赘述。
7．PCR添加剂：
PCR的添加剂主要包括能够增加反应退火效率的化学因子、DNA结合蛋白和一些商业试剂。基本的原理是增加引物退火特异性，减少错配，增加产物的长度和产量。
在富含GC情况中，添加剂可以造成配对碱基间的不稳定，从而提高扩增的效率。添加剂还可以造成错配的引物和模板复合物极大的不稳定，从而提高了扩增的保真性。但要注意的是，没有通用万能的添加剂，需要根据实际情况，最好结合梯度PCR选择最优条件。常见的添加剂有二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、甲酰胺、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)6000、甘油、基因32蛋白、甜菜碱及牛奶血清蛋白(albumin from bovine serum, BSA)等。
三、质量控制体系设置
要进行有效的荧光PCR检测，建立完整的质量控制体系是关键[11]。质量控制体系可分为外部质量控制和内部质量控制。所谓外部质量控制体系主要是指在进行目的基因检测的同时，平行设置的已知结果的样品检测，主要监控荧光PCR检测结果是否可靠。
1．外部质控体系：
(1)定量标准品：定量核酸扩增检测试剂需要得到目的基因的绝对量，最简单的方法就是标准曲线法[12]，即用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。这一方法虽然简便，但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和模板的准备过程。(2)阳性对照品：阳性对照主要作用是判断试剂是否正常扩增，扩增的效率是否有偏差，一般会设置一个高点和一个临界点，称之为强阳性对照和临界阳性对照，样本类型和定量标准品一致。(3)阴性对照品或空白对照：阴性对照主要是判断试剂是否存在假阳性的问题，每次阴性对照应该检测为阴性(低于检测下限)，说明实验结果为可靠。也有实验者增加一个空白对照，即不加入任何模板或提取产物，仅试剂单独扩增，主要目的是监控实验室环境是否存在污染的风险。
2．内部质量控制体系：
在绝大多数的实验中，要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品作为外参照的不足，引入一个内参照目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR[13]。但是，由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比仅使用外参要显著缩小，常可至2～3个数量级。
四、核酸提取、纯化的方法学要求
核酸提取是进行绝大多数核酸扩增反应的前提条件，核酸提取和纯化的效率及纯度直接影响整体核酸扩增检测的效率、灵敏度及特异性[14]。
核酸提取纯化的方法包括煮沸法、柱提取法及磁分离法等。其中磁分离法的提取效能具有较大优势，并可实现自动化操作。核酸提取纯化的自动化是发展方向，磁珠提取法是临床应用的重点。磁珠提取法原理：磁珠是由具有超顺磁性的磁核表面包裹二氧化硅等材料构成，利用这些磁珠可以实现核酸提取的自动化操作，磁珠在一定条件下对核酸、蛋白具有很强的亲和力，并且在条件改变时，磁珠与其吸附的核酸分离，因此可以利用磁珠提取纯化各种核酸。磁珠提取方法的适用范围包括全血[如枸橼酸盐、肝素或乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)等抗凝剂处理过的全血]、血清、白细胞、培养细胞、各种植物组织、病毒DNA、RNA、质粒DNA及其他特殊类型标本(组织块、干血点、尿液、唾液、头发及等)。磁珠提取技术不需要乙醇沉淀、苯酚或氯仿提取、离心或者柱纯化，只需要洗涤液或者洗脱液。自动化的磁珠法提取技术即能将实验员从手工抽提的复杂工作中解放出来，又能保证核酸提取纯化操作的一致性。
五、结语
在国标YY/T 1182–2010《核酸扩增检测用试剂(盒)》中，对体外诊断用HIV、HBV、HCV核酸扩增检测试剂盒产品提出明确要求：(1)在产品设计中，应加入全程参与的内标；(2)在扩增检测前，样品(含质控品、标准品)应该进行核酸提取、纯化；(3)核酸加样体积不小于20 μl；总反应体积不小于40 μl。
2013年，，其中对HBV DNA检测试剂盒的要求：(1)用于检测HBV DNA的样本量应不少于200 μl；(2)将具有95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检出限，最低检出限应不高于30 IU/ml；(3)样本反应管应设置合理的内对照(内标)以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质量控制。
这些要求部分反映了文中前面讨论的体系设置的要求，但仍然不够细化。在荧光PCR(含RT–PCR)产品的试剂反应体系中，引物、探针及反应液的设计要充分考虑临床中可能出现的各种情况，需要满足测量线性、准确度、分析特异性、亚型检测能力、精密度、检测限、定量限及干扰物质等的基本要求。同时，在质量控制体系设置和提取方法两个方面的要求需要强化。
质控品合理设置对于PCR试剂的精度以及稳定性是至关重要的。文中重点阐述的PCR试剂质控品设置要求，对于定量标准品、阳性对照、阴性对照等质控品应当选择与待测样本同样来源的样本，或者可以使用假病毒替代，并全程参与提取，这样可以保证质控品的扩增效率和待测样本保持一致。内参质控可以选择管家基因或者人工设计的外源基因作为内部质控品，同样内部质控品需要进行核酸的平行提取，全程监控试剂假阴性的可能。
不同的核酸提取/纯化方式也会对检测的重复性和灵敏度造成很大影响。笔者曾经对比磁珠法和煮沸法对HBV国家参考品L3样本提取产物测定的重复性结果，分别连续10个重复测定两种方法的L3样本提取产物，其浓度对数值的变异系数分别为2.3%(磁珠法)、6.8%(煮沸法)，采用煮沸法提取样本最终检测浓度的偏差明显大于使用磁珠法提取的检测结果。分析根本原因还是由于煮沸法无法去除血浆中存在的大量干扰物，这些干扰物对PCR产生抑制作用，而这些干扰物在提取产物中不均匀分布，最终导致PCR检测的不均一性。另外，磁珠法提取可有效地提高检测灵敏度，主要由于磁珠法一方面对样本进行浓缩，同时非常有效地去除所有的PCR抑制物，而煮沸法虽然对样本同样采取了浓缩HBV的方法，但是在浓缩HBV病毒的同时，PCR的抑制物也同样进行了富集，对PCR造成更大的影响，最终影响到检测灵敏度。
PCR技术的临床应用发展迅速，基于核酸扩增检测试剂的开发、生产及应用，笔者阐述了核酸扩增类试剂体系设置要求、质量控制体系的建立以及核酸提取的方法学要求，以期对相关标准的建立起到推动作用。集成化、自动化、小型化是核酸检测设备的发展趋势，而核酸扩增检测试剂也需要在严格的体系设置要求下与设备共同发展，从而构建完备的系统解决方案。
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