943期-1:【聚焦】二代测序(NGS),崭新的分子病理时代

NGS在分子病理中的应用

思路迪精准医疗研发副总裁李福根博士首先就如何建立用于分子病理诊断的NGS平台发表演讲，从实体瘤、液体活检、检验实验室的内部质控和外部质评等多角度分析如何建立符合临床检测要求的NGS平台。李福根谈到，NGS测序技术发展已有多年，但是由于多基因检测涉及SNV/Indel，CNV等多种突变类型、突变频率和分布也存在较大差异，为了保证临床应用的准确性，用于临床诊断目的的NGS检测平台必需经过严格验证。思路迪已建立了一系列商业化肿瘤细胞系，作为中国唯一拥有自主标准参考品的公司，思路迪的NGS平台采用体外DNA，肿瘤细胞系和组织FFPE样本的三重验证，结果表明组织样本的肿瘤细胞含量达到20%，测序深度达到500X才能够确保NGS检测用于临床诊断的灵敏度和特异性。基于严谨的科学验证结果，思路迪受邀参与吴一龙教授牵头、中国临床肿瘤学会（CSCO）和中国肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）联合制定的NGS技术应用于临床肿瘤精准医学诊断的共识，并且在最终颁布的共识关键技术参数上有所贡献。

接着，李福根介绍了思路迪液体活检平台的技术及验证情况。由于常规NGS检测不能达到液体活检的灵敏度要求，思路迪采用新的建库技术，在测序前为每个ctDNA片段增加了特异性的分子标签，同时通过生物信息算法优化，高效降噪，提高低丰度变异的检出率。由于在测序和数据分析环节的独特优势，思路迪的ctDNA测序在提高测序深度的同时大大增加有效数据量，平均有效检测深度在5000X左右，检测下限达到万分之三，可以比传统的ctDNA检测方法多检测出28%的变异。经过肺腺癌临床样本验证，思路迪采用了全新ctDNA测序方法的液体活检平台在灵敏度各项指标上可与国际一流液体活检公司Grail和Guardant360公司相媲美。

除了技术方面的验证，李福根还介绍了思路迪NGS平台如何通过严格的内外部质量管理体系保障检测结果的准确性，满足临床应用标准。今年以来，思路迪已连续五次通过国内外机构组织的基因检测室间质评，包括刚公布的家卫计委ctDNA基因突变检测室间质评，上海市临检中心和美国病理协会CAP组织的能力验证。

NGS数据注释在遗传性肿瘤中的实践

接下来，中山大学肿瘤防治中心分子诊断科邵建永教授与大家分享了他在NGS数据注释中的宝贵经验。NGS测序会产生大量的原始序列数据，拿到原始序列数据后对数据进行初级处理，对剩下的数据进行序列比对进而计算出覆盖度以及变异识别即精准捕捉基因点突变、缺失、插入等多种变异信息，并注释。拿到注释结果后做与疾病相关的解析，由此可以进行早期分子分型诊断，帮助患者后续全程管理，及早发现患者的基因亚型，对于后续疾病复发、耐药等策略制订个体化方案。因此，NGS数据注释和解读是肿瘤精准医疗中的难点和关键点。

邵建永教授讲到，NGS数据注释存因基因变异的复杂性而存在许多陷阱。其中包含肿瘤基因组变异的复杂性及基因变异鉴定和分析的复杂性。美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南提供了遗传基因变异注释的解读标准及指导原则，使用高通量测序检测孟德尔遗传病致病基因时，整合连锁分离、新发变异、等位基因数据、其他数据库、人群中分布频率、计算和预测数据、功能验证情况这8类研究证据将变异分为五类：致病的（Mut）、可能致病的（VLM）、致病不明的（VOUS）、可能良性的（VLB）、良性的（Poly）。

随后，邵建永教授结合了自己的经历来帮助大家理解ACMG标准。一例女性卵巢癌乳腺癌双原发、一例男性肺癌均检测出携带BRCA2基因遗传系变异，而该变异未在任何数据库或文献中有过报道，通过规范基因注释流程及后期功能验证，如果功能实验证实该突变是有临床意义的（即为VLM型），将会是世界上首次对BRCA2基因变异进行报道，从而实现了临床到科研的转化。

邵建永教授讲到了目前正在与思路迪公司合作进行的近600例肠癌患者的遗传性肠癌易感基因变异类型研究初步结果表明，MSH1、MSH6两个MMR基因的变异均诱导肠癌突变增多，且MMR基因缺陷的mCRC患者用PD-1单抗治疗获益更明显。同样的，今年发表的InSiGHT数据库中遗传性肠癌MSH1、MSH6基因的变异频率同样很高。

不完善的流程和不结构化的数据库对注释造成很大误导，规范的注释流程结合人工判读有助于临床医生发现更多新的信息（如，基因变异具有的潜在价值）。以VOUS功能预测为例（图1），大批量样本基因变异注释完后因为数量较多，不可能对所有变异进行功能验证，通过功能预测后，可优先对其中可能的有害变异进行实验验证。

图1 VOUS功能预测

肿瘤免疫微环境的病例评价

经过长达1个半世纪的探索，近十年可谓是肿瘤免疫学的“复兴时代”。而提到肿瘤免疫治疗，就不得不说由肿瘤细胞、免疫细胞、免疫细胞表面的受体及配体、细胞因子、趋化因子构成的肿瘤免疫微环境（TME）。免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与TME内免疫调节的相互作用。免疫检查点是指通过共抑制或共刺激信号一系列途径以调节T细胞活性，以防止在正常情况下发生自身免疫疾病的功能（图2）。那么，从病理角度如何评价TME及免疫检查点？

图2 免疫活化与免疫检查点

来自北京医院的王征教授为大家进行了解答。王征教授说，提到TME的病例评价，就不得不说起Klintrup-Makinen分级。按照肿瘤炎性细胞在肿瘤中心（CT）和浸润边缘（IM）的浸润程度共分为4级：0级——没有；1级——微弱；2级——中度；3级——严重浸润。2006年，法国Galon教授通过肿瘤和浸润区域的免疫组化标记物CD8+和CD45RO+检测更加细化了KM分级，并结合肿瘤TNM分级提出了免疫评分（Immunoscore）的概念（图3）。Galon免疫评分系统在临床应用中发现，95%的Ⅰ4患者18年没有出现复发，而50%的Ⅰ0患者2年内就出现了肿瘤复发，可见肿瘤免疫评分有强烈提示预后价值的指标。肿瘤微环境的病理评价，包括组织学改变评价及免疫组化免疫细胞分类的评价，有望成为不同瘤种国际指南推荐的评价预后指标。值得注意的是，Galon免疫评分在使用过程中要保证流程及试剂的标准化，数字病理及图像分析技术应用是肿瘤免疫评分是增加评分客观性及可重复性的关键。

图3 Galon免疫评分

接下来，王征教授讲到了免疫检查点治疗相关病理评价。PD-L1的阳性状态与免疫检查点治疗的疗效相关。目前不同临床研究所用的检测抗体及检测平台、判读标准均存在较大差异，给临床检测带来很大的困惑，减低了检测结果的一致性、重复性。寻找其他免疫检查点抑制剂的生物标志物非常关键，比如错配基因（MMR）和mutation burden.。研究证实MMR和mutation burden可以预测免疫检查点治疗的疗效，MRD的患者也更容易出现高突变负荷，对免疫检查点抑制剂效果显著。其他生物标志物尚在研究中，期待未来新的研究进展。