Nature Method连发两篇Brief Communication讲的新型纳米孔测序技术怎么玩的 || PrediClub

传统的亚硫酸氢钠法有哪些弊端

 长久以来，学界一直采用亚硫酸氢钠法（bisulfite genomic sequencing）对5mC进行检测：亚硫酸盐处理可以使得DNA上未发生甲基化修饰的胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶，再经过PCR转化为胸腺嘧啶。因此，通过对化学处理前后的DNA片段进行测序，可以比对刻画出DNA序列中的甲基化修饰图谱。

但是，受限于化学处理的可靠性，要精确刻画出单分子修饰的情况，往往需要在同一个位点有足够的重复度才能得出结论；同时，盐处理可能会导致DNA分子的片段化，进而阻断片段下游序列的扩增。这些都对DNA样品的质量和测序通量提出了相当的要求，从而增加了甲基化检测的时间和经济成本。

纳米孔测序技术亮在哪里

今年4月，Nature Method连发两篇Brief Communication，介绍通过新型的纳米孔测序技术，可以更加高效地检测DNA上的甲基化修饰。

纳米孔测序技术可以被认为是当下发展最为迅速的单分子测序技术的一种，其基本原理是：蛋白质纳米通道被镶嵌在一个绝缘的聚合物膜上，纳米通道的孔径可以被需要检测的分子阻塞，通道的两端设有电极可以检测纳米孔局部的电流强弱。

测序过程需要在电泳状态下进行，在没有分子通过纳米孔的情况下，电极可以检测到恒定的电流。如图1所示，当DNA分子单链在电泳的作用下通过纳米孔时，因为不同碱基的大小和电子云形态不一致，4种碱基会在不同程度上阻塞纳米通道，进而使局部电流产生不同的变化。通过分析这些变化的特征，在每一个碱基通过纳米孔的过程中，测序仪可以快速读出碱基的类型。

图1     纳米孔测序的局部结构示意

纳米孔测序的文库准备过程与正常的二代测序并没有显著区别，唯一不同之处在于添加接头的过程需要把整个双链DNA变成“发卡结构”，这样一来，DNA的两条链就可以连续不断的穿过纳米孔完成测序。

纳米孔测序的每一块测序芯片上都镶嵌着数千个纳米孔通道，一个纳米孔通道也可以连续读出不断通过的大量文库片段，这样一来，纳米孔测序可以在短时间内达到高通量测序的目的。

图2     数千个纳米孔阵列构成测序芯片

在DNA甲基化的检测方面，纳米孔测序技术的优势是显而易见的：5mC相比于正常的胞嘧啶具有显而易见的不同分子特征，在通过纳米孔时可以显著的区分出来。如此一来，不需要对DNA分子进行任何的前处理，直接进行纳米孔测序，就可以快速读到单分子的甲基化信号，无论是从信号的精确性和操作的简易性来看，抑或是考虑到时间和经济的成本，纳米孔测序技术都具备着无可比拟的优越性。

图3  使用纳米孔测序检测亨廷顿舞蹈症致病基因，文库制备时添加接头可以使双链DNA转化为发卡结构，从而连续完成正反链的测序

纳米孔测序检测DNA甲基化修饰

两篇刊载于Nature Methods文章的实验结果如图4显示，使用纳米孔测序可以在甲基转移酶处理的情况下显著地将5mC与未甲基化的碱基区分开来。

图4  纳米孔测序检测PCR扩增后的的大肠杆菌DNA，未甲基化（蓝色）与甲基化（绿色，M.Sss1甲基转移酶处理）信号统计有显著差别

在对人类基因组进行测序的过程中，生物信息学分析显示使用不同纳米孔对单分子5mC的检测精度介于83%～87%。而如图5所示，使用纳米孔测序结果分析转录起始位点附近的DNA甲基化情况时，相比于传统的亚硫酸氢钠法，纳米孔的结果可以更灵敏地检测到TSS上的低甲基化，暗示着纳米孔检测更加精确。

图5  使用不同方法检测人类基因组TSS附近甲基化情况，不同纳米孔都显示出比传统方法更高的灵敏性

从图6来看，除5mC以外，其它DNA的甲基化修饰如6mA也可以用纳米孔测序进行检测，尽管与5mC相比，6mA与正常腺嘌呤在通过纳米孔时的差异较小，但仍然可以区分得出明确的单分子甲基化信号，可以通过提高通量、增加重复率弥补其准确性上的不足。

   图6 纳米孔测序检测5mC和6mA显示出不同的精确性

随着对中心法则的补全精确到单碱基、单分子，传统的碱基测序手段已疲于应对诸多殆需跨越的技术鸿沟。

纳米孔测序技术毫无疑问是单分子测序的未来，它具备有别于二代测序的全新技术思想。二代测序在核心思想上仍未离开Sanger的窠臼，即通过荧光标记（或其它理化特征）单核苷酸检测与之互补配对的碱基；而纳米孔测序则是直接在单碱基水平上对分子进行扫描。正是这种核心技术思想的革新，使纳米孔测序具备更加广阔的发展前景，使之跻身于次世代测序（三代测序）的领头羊地位。

诚然，当前技术水平下的纳米孔测序还存在诸多不足：对于未修饰DNA的检测，纳米孔测序并未表现出更高的优越性；芯片设计有待优化，整体的检测通量仍有提高的空间；测序精确性及可靠性需要更多的实验数据验证。

但是，我们正处于一个技术飞跃性成长的浪潮之中，我相信纳米孔测序或其衍生技术成为主流的那一天，已不再遥不可及。

参考文献：

[1] Rand A C, Jain M, Eizenga J M, et al. Mapping DNA methylation with high-throughput nanopore sequencing[J]. Nature Methods, 2017.

[2] Simpson J T, Workman R E, Zuzarte P C, et al. Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing[J]. Nature Methods, 2017.

[3] Sequencing, analysing and counting short tandem repeats on the MinION™ – counting STRs in Huntingdon’s Disease cell-line samples. Nanoporetech. [4] https://nanoporetech.com/publications/2015/08/04/sequencing-analysing-and-counting-short-tandem-repeats-on-the-minion-2