Cas9文库的四部曲(三) | 文库的制备标准

Get到如何选择文库类型和细胞系后，科研宝宝们离自己全基因组筛选工作的成功更进一步啦！接下来呢，升级版的慢病毒文库质量控制会让您拿到打开成功大门的钥匙~~~开心吧~~~

sgRNA靶向基因位置

根据研究者感兴趣的基因，sgRNA结合到靶基因的区域有相应的原则：CRISPR knockout，sgRNA结合到靶基因5‘保守的外显子区域；CRISPRi或者CRISPRa，sgRNA结合到靶基因的转录起始位点的上游或者下游。

sgRNA靶向序列

选择所有可能和Cas9同源特异性的前间区序列临近基序（PAM）的sgRNA靶点序列均是依据以下四个原则：①低脱靶活性，②高靶向结合活性，③避免连续相同的碱基序列，④GC含量适中。

sgRNA数量

研究数据表明sgRNA特异性和效率非常重要。在保证实验设计完整前提下，可以通过在文库里引进更多的sgRNA提高文库的准确性，在鉴定一个表型的时候需要多个sgRNA（6个）来鉴定同一个基因，不仅可以减少一些sgRNA的低效率而产生的假阴性，而且可以通过多个sgRNA同时佐证基因型和表型之间的相对应关系。

举例说明：对于基因敲除的筛选文库，GeCKO v2文库靶向19，050个人类编码基因或者20，611个鼠编码基因，每个基因包括6个sgRNA（图a），另外该文库也涵盖了1864个人的miRNAs或者1175个鼠的miRNAs，每个miRNA有4个sgRNA；每个物种文库包含了1000个非靶向的对照sgRNAs，GeCKO文库有两种存在形式，单质粒（lentiCRISPR v2）和双质粒（lentiCas9-Blast和lentiGuide-Puro）（图b）。

对于基因激活的筛选文库，SAM文库靶向的是23,430个人源或23,439个鼠源的编码序列转录起始位点的上游200bp位置，并且每个亚型有3个sgRNAs（图c）；SAM文库的使用需要结合具有SAM效应的双质粒或者三质粒同时进行（图d）。

如何满足病毒文库的高质量，必需满足两个条件，一是文库的覆盖度高、均一性好；二是病毒文库的滴度、纯度保证。

质粒DNA文库的扩增

慢病毒文库是由质粒文库通过慢病毒包装获得，由于初步芯片合成后构建的文库质粒量有限，因此，需要扩增质粒DNA。在扩增的过程中，通常采用电转化方法将质粒DNA转入到细菌中，并且通过LB agar平板完成菌落的富集（LB agar培养基而非LB液体培养基，避免生长优势菌大量扩增从而导致sgRNA的均一性降低）。

质粒DNA文库的富集程度

一般来说，建议转化的克隆子数量在文库sgRNA靶点总数的100-300倍，即每个单一的sgRNA需要收集100-300克隆菌落。举例说明，如果一个文库靶向20000个基因，而每个基因需要6个sgRNA，即含有120000个gRNA的质粒，那么需要收集1.2x10⁷~3.6x10⁷克隆菌落，方可满足该文库中每个gRNA有100-300的丰富度。

扩增后的质粒文库，进行NGS测序，通过测序结果得到每条sgRNA的数量，从而来评估文库的覆盖度和均一性，这样的文库质量评估在功能筛选上是非常重要的。可以有效避免sgRNA的缺失导致的筛选阳性靶点的遗漏以及假阳性结果。

质粒文库经扩增并通过NGS验证后，下一步就是包装sgRNA病毒文库。

一般说来，HEK293T细胞是用于生产CRISPR文库的包装细胞。CRISPR文库、合适的包装质粒以及包膜蛋白质粒共转染HEK293T细胞，转染48H后收集病毒上清液，并且经过一系列的浓缩、纯化工艺，得到用于细胞筛选的慢病毒文库。

病毒文库包装细胞数

在病毒包装过程中，质粒的转染效率大概是10^-5~10^-3，通常加入质粒的总量（DNA拷贝数）远远大于细胞总数。因此，同质粒扩增为保证文库丰富度（即覆盖度）的重要原因一样，建议包装的细胞总数是文库靶点总数的1000~10000倍。以靶向20000个基因的文库为例，每个基因6个靶点，即含有120000个sgRNA的质粒，因此包装的细胞总数大概是1.2x10⁸~1.2x10⁹。

病毒文库质量要求

在慢病毒包装过程中，主要目的是获得高滴度、高纯度的sgRNA慢病毒文库。高质量的CRISPR慢病毒文库对于后续的细胞筛选具有非常中的意义。结合前文《Cas9文库四部曲（二）》中关于细胞的选择中我们提到的：需要选择慢病毒感染效率高的细胞系进行研究，因此，需要提高慢病毒文库的病毒纯度和滴度来提高慢病毒对细胞的感染效率。

病毒文库成功关键

在慢病毒文库包装过程中，存在单质粒系统（cas9和gRNA基因在一个质粒上）和双质粒系统（cas9和gRNA在两个质粒上）。单质粒系统是质粒DNA上同时含有cas9蛋白基因和sgRNA，双质粒系统是sgRNA和cas9蛋白基因分别构建在两个质粒上，随后包装成CRISPR病毒文库。根据慢病毒包装容纳限制的特点，同样的包装工艺，双质粒系统产生的慢病毒文库滴度较高。当然，高产的包装细胞、成熟的包装工艺以及优化的浓缩、纯化工艺是产生高滴度、高纯度CRISPR慢病毒文库的最主要关键所在。

最后的最后，还有一个非常重要的质控点（通过文库使用，确定使用的细胞数、MOI和NGS的深度），敬请关注哦~~~