文章来源：中华骨科杂志, 2016,36(10): 627-634
作者：周泽著 郑月焕 陈哲 施莺莺 黄晓虹 王晓宁 曹鹏
目的
探讨经尾静脉注射新型钾离子通道阻滞剂4-氨基吡啶-3-甲醇(4-aminopyridine-3-methanol，4-AP-3-MeOH)对大鼠慢性脊髓损伤的治疗作用。
方法
选取18只成年健康雄性SD大鼠，随机分为3组：4-AP-3-MeOH治疗组、生理盐水对照组和假手术组。对4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠均行脊髓T10节段水平压迫损伤，28 d后每日对4-AP-3-MeOH组进行尾静脉注射4-AP-3-MeOH 1 μmol，连续注射4周；生理盐水组同期注射等量生理盐水。对假手术组大鼠仅行T10椎板切除，不压迫脊髓。所有大鼠术后行Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分和斜板试验评价行为运动功能，同时行体感诱发电位(somatosensory evoked potential，SEP)和运动诱发电位(motor evoked potential，MEP)检测。
结果
术后4周，4-AP-3-MeOH组和生理盐水组在行为学(BBB评分和斜板试验)和神经电生理检测结果差异上均无统计学意义。4-AP-3-MeOH组从第6周开始BBB评分逐渐增加并高于生理盐水组，差异有统计学意义，但两组各时间点BBB评分均小于假手术组，差异均有统计学意义。4-AP-3-MeOH组与生理盐水组的斜板角度从术后第1天到8周的差异均无统计学意义，且均小于假手术组，差异均有统计学意义。神经电生理检测发现从第4周到第8周4-AP-3-MeOH组的SEP和MEP波幅值均高于生理盐水组，差异有统计学意义，但低于假手术组。组织学染色：假手术组大鼠脊髓形态完整，灰白质分界清晰；4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠脊髓可见灰质结构消失，，白质周边可见脱髓鞘病变。同时4-AP-3-MeOH组大鼠脊髓损伤中心处的残存髓鞘百分比高于生理盐水组(0.56±0.06 vs 0.42±0.05)。
结论
大鼠慢性脊髓损伤时，于尾静脉长期连续注射4-AP-3-MeOH可以在一定程度上促进脊髓的神经传导功能恢复，改善大鼠的感觉和运动功能。
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是临床上一种非常复杂和严重的疾病，往往导致患者感觉、运动和自主神经功能等受到损害，严重者会导致截瘫甚至死亡[1]。而当前由脊柱退变所致的脊髓长期压迫和神经退行性疾病引起的脊髓慢性病变患者日趋变多，从而导致慢性脊髓损伤患者的数量逐渐增加，该病常可继发引起多种病症如深静脉血栓形成、感染、骨质疏松，甚至出现神经不可逆性损伤，肢体瘫痪等，是一种高致残率高耗费的疾病，以致严重影响了患者的生活和工作能力，是一个严重的社会和经济问题[2,3,4]。因此研究和发现慢性脊髓损伤修复治疗方法具有非常重要的社会及临床意义。
研究表明轴突脱髓鞘改变是脊髓损伤的重要病生理变化，其中慢性脊髓损伤时脱髓鞘病变持续广泛存在且轴突脱髓鞘改变沿着周围白质纤维束逐渐扩展[5]，轴突脱髓鞘改变导致轴突钾离子通道异常暴露，影响神经冲动的正常传导，从而造成患者的长期感觉和运动障碍[6,7,8]。同时慢性脊髓损伤与急性脊髓损伤相比，慢性脊髓损伤时神经纤维再生能力低下，且损伤部位周围环境不支持轴突的长距离再生[9]。鉴于慢性脊髓损伤的这些病理特点，其给损伤后修复带来很大困难，但是可以通过改善脊髓损伤轴突髓鞘化来促进神经功能恢复[10,11]。而钾离子通道阻滞剂作为一种改善轴突髓鞘传导功能的药物逐渐成为治疗慢性脊髓损伤的新选择。多项研究证实钾离子通道阻滞剂能够改善脊髓损伤后轴突传导功能，如现临床上应用的4-氨基吡啶治疗脊髓损伤及多发性硬化症患者，但其小剂量或短期应用均难以达到较好的治疗效果，而大剂量或长期应用常可导致很多不良事件的发生，如呼吸抑制，诱发癫痫，及焦虑等不良精神心理改变，从而限制其长期应用于慢性脊髓损伤[12,13,14]。因此研究效果更好且发生不良事件更少的钾离子通道阻滞剂是临床治疗脊髓损伤的关键。
结合以上研究背景，本研究在构建一种大鼠慢性脊髓损伤模型的基础上，采用新型钾离子通道阻滞剂4-氨基吡啶-3甲醇(4-aminopyridine-3-methanol，4-AP-3-MeOH)经尾静脉注射治疗大鼠慢性脊髓损伤，目的在于：①探讨大鼠活体内应用4-AP-3-MeOH治疗SCI的可行性；②探讨长期应用4-AP-3-MeOH治疗大鼠慢性脊髓损伤的作用。
材料与方法
一、实验材料
(一)实验动物及分组
健康雄性sprague-dawley(SD)大鼠18只，体重250~300 g(由上海斯莱克实验动物有限公司购得)，均为无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级。随机平均分为4-AP-3-MeOH治疗组、生理盐水对照组和假手术组共3组。
本实验通过上海交通大学医学院动物伦理委员会批准实施。
(二)主要实验试剂及仪器
4-氨基吡啶-3-甲醇(Alfa aesar公司，美国)；LFB染液(Sigma公司，美国)；神经电生理仪器(Nicolet endeavor公司，美国)；显微镜-图像分析系统(Axio vision SE64，德国)。
二、实验方法
(一)实验动物模型制作及给药治疗方法
采用质量浓度为2.5％的钠腹腔注射麻醉实验大鼠(50 mg/kg)，背部术区备皮后，将其俯卧位固定，常规消毒铺巾。以T10棘突为中心，取后正中切口，切开皮肤及皮下组织，钝性分离T9~11节段椎旁肌肉，显露椎板，咬除T9~11棘突和椎板，充分暴露T10节段的脊髓。参照Blight等[15]的方法用特制的钳子钳夹T10脊髓10 s(垂直于脊髓纵轴，钳子头端宽度为5 mm，钳夹后间隙为1.2 mm)，大鼠尾巴出现痉挛性摆动即证明造模成功，随后逐层缝合伤口。4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠的造模均采用上述过程；假手术组大鼠只切除相应节段椎板，不损伤脊髓。
术后所有大鼠均分笼饲养，定时按摩膀胱直至自行排尿，每天肌肉注射庆大霉素(40 000 iu)，连续注射1周。
根据Houle等[16]对慢性脊髓损伤的时间界定方法，所有实验大鼠术后饲养四周后，4-AP-3-MeOH组大鼠每天定时尾静脉注射1 ml 4-AP-3-MeOH(1000 μmol/L)，连续注射4周；生理盐水组大鼠尾静脉注射等量生理盐水，连续注射4周；假手术组大鼠不做任何处理。
(二)行为学观察
分别于术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d观察所有实验大鼠的运动功能情况，包括Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分[17]和斜板试验[18]。BBB评分采用双人双盲独立进行观察记录，然后计算平均值。斜板试验是将大鼠放置在一斜板上，通过调整斜板角度获取大鼠在斜板上维持5 s的最大角度值。同时观察大鼠有无药物毒性反应，如抽搐、昏迷甚至死亡等。
(三)神经电生理检测
分别于术后4周、5周、6周、7周、8周检测大鼠体感诱发电位(somatosensory evoked potential，SEP)和运动诱发电位(motor evoked potential，MEP)。
SEP检测：使用质量浓度为2.5％的钠腹腔麻醉，按国际脑电图学会制定的系统，检测大鼠后肢胫神经诱发电位。记录电极置于Cz点，参考电极置于FPz点，接地线置于前额旁开，刺激电极放在双侧内踝部胫后神经处，采用方形刺激波，强度为3 mA，频率4.1 Hz，记录N20波幅值。
MEP检测：大鼠麻醉状态下，剪去颅顶毛，消毒后在矢状缝旁开左右2 mm处C3'、C4'切开皮肤及皮下，将钩状刺激电极钩于皮下。记录电极置于大鼠下肢腓肠肌处，参考电极放在足底部，给予矩形刺激波，强度8 V，波宽100 ms，引出波幅值并记录。
(四)组织学观察
所有大鼠完成第8周的电生理检测后，将大鼠腹腔注射过量质量浓度为2.5％的钠(约为1 ml)处死，经左心室滴注肝素生理盐水至前后腔静脉流出澄清液，使用4％多聚甲醛溶液灌注固定，暴露损伤处的脊髓，迅速取出损伤中心，置入4％多聚甲醛中，4℃冰箱内过夜，然后将组织脱水及石蜡包埋后，连续5 μm石蜡切片，行HE染色和LFB染色。
同时取4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠脊髓LFB染色横切片，显微镜下观察并用图像分析系统AxioVision SE64 Rel.4.9定量分析每张切片残存髓鞘面积及横切片上脊髓总面积，取平均值为该大鼠的残存髓鞘面积和脊髓总面积。参照Joshi等[19]的方法计算残存髓鞘面积百分比(LFB着色部位面积／横切片脊髓总面积×100%)。
三、统计学分析
采用SAS 8.0(SAS公司，美国)统计软件进行统计学分析。计量资料(BBB评分、斜板试验角度、残存髓鞘面积百分比)采用![]()
±s表示，对4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠的BBB评分、斜板实验角度及神经电生理检测结果采用单因素方差分析进行比较，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls检验；4-AP-3-MeOH组和生理盐水组间的残存髓鞘面积百分比采用成组t检验。检验水准α值取双侧0.05。
结果
一、行为学检查结果
所有实验大鼠无发现死亡及药物毒性反应。术前4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠BBB评分均为21分、斜板试验角度均为75°~80°。4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠脊髓损伤后双后肢均表现为全瘫。
(一)BBB评分
术后各时间点4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的BBB评分均小于假手术组，术后1 d时，4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的BBB评分均为(0±0)分，假手术组为(20.2±0.4)分；至术后8周时4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的BBB评分分别为(16.0±0.6)分、(15.0±0.6)分，假手术组为(21±0)分，差异均有统计学意义，分别比假手术组低5分和6分；术后5周内，4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的BBB评分差异均无统计学意义，但从术后第6周开始，4-AP-3-MeOH组的BBB评分(16.0 ± 0)分，大于生理盐水组的(14.8±0.4)分，差异有统计学意义，高出1.2分，至第8周时分别为4-AP-3-MeOH组(16.0±0.6)分和生理盐水组(15.0±0.6)分，差异均有统计学意义，4-AP-3-MeOH组高出生理盐水组1分(表1)。
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(二)斜板试验
4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的斜板试验角度在术后各时间点相差不大，差异无统计学意义，但此两组均小于假手术组斜板试验角度。术后1d时，4-AP-3-MeOH组的斜板试验角度为30.8°±2.0°，生理盐水组为31.7°±2.6°，均明显低于假手术组的75.8°±2.0°；至术后8周时，4-AP-3-MeOH组斜板试验角度为69.2°±4.9°，生理盐水组为65.0°±4.5°，假手术组为80.8°±3.7°，假手术组的斜板试验角度最大，其次为4-AP-3-MeOH组，两两比较，差异均有统计学意义(表1)。
二、电生理检测结果
4-AP-3-MeOH组大鼠术后4周时的SEP波幅值为(0.64±0.15)μv，MEP为(27.40±6.32)μv，与生理盐水组的SEP波幅值(0.65±0.13)μv和MEP波幅值(28.03±5.03)μv相比，差异无统计学意义(t=0.09，P＝0.926；t=0.20，P=0.845)，但明显分别均低于假手术组的SEP波幅值(1.92±0.21)μv和MEP波幅值(77.98±5.10)μv，且差异具有统计学意义(t=13.27，P=0.000；t=15.88，P=0.000)，说明大鼠慢性脊髓损伤模型制作成功，4周时慢性脊髓损伤大鼠神经电生理功能趋于稳定。
4-AP-3-MeOH组大鼠治疗7 d后，SEP和MEP波幅值逐渐增加，用药4周后SEP达(1.52±0.13)μv，MEP达(40.47±3.59)μv；而生理盐水组和假手术组大鼠SEP和MEP波幅值在此阶段无明显变化。
4-AP-3-MeOH组大鼠35 d、42 d、49 d、56 d时的SEP和MEP波幅值均明显高于生理盐水组大鼠的波幅值，差异均有统计学意义，但是均低于假手术组大鼠波幅值。至第8周时，4-AP-3-MeOH组SEP波幅值平均较治疗前(4周时)提高2.38倍，而MEP波幅值平均提高1.48倍；而生理盐水组和假手术组SEP和MEP波幅值平均较治疗前(4周时)无明显提高(图1)。
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图1 4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠4~8周的SEP和MEP波幅值变化趋势 A 4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠的SEP变化情况：4-AP-3-MeOH组大鼠治疗后SEP波幅值逐渐稳定增加，治疗1周后波幅值高于生理盐水组，差异有统计学意义，至第8周时波幅值较治疗前明显增加，但低于假手术组，生理盐水组和假手术组大鼠SEP波幅值未见明显变化 B 4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠的MEP变化情况：4-AP-3-MeOH组大鼠治疗后MEP波幅值逐渐增加后并趋于稳定，治疗一周后波幅值高于生理盐水组且差异有统计学意义，至第8周时波幅值较治疗前稍增加，但低于假手术组，生理盐水组和假手术组大鼠MEP波幅值未见明显变化
三、组织学检查结果
所有大鼠处死后，损伤中心行HE和LFB染色。
HE染色结果发现：，灰质结构基本消失，白质周边可见少量囊泡，白质松散不规则；假手术组大鼠HE染色脊髓灰白质结构分界明显，无囊泡及空腔(图2)。
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图2 4-AP-3-MeOH组、生理盐水组及假手术组大鼠脊髓组织学形态，HE和LFB染色×100 A 4-AP-3-MeOH组大鼠HE染色：，灰质结构基本消失；LFB染色：白质轴突髓鞘完整性破坏，周边可见脱髓鞘病变(黑色箭头) B 生理盐水组大鼠HE染色：，灰质结构基本消失，白质周边可见少量囊泡；LFB染色：白质周边脱髓鞘病变(黑色箭头) C 组大鼠HE和LFB染色：脊髓灰白质结构完整，灰质中神经元细胞分布均匀，形态正常，白质中神经纤维排列整齐
LFB染色发现：4-AP-3-MeOH组和生理盐水组大鼠脊髓结构紊乱、灰质周边脱髓鞘病变；假手术组大鼠白质轴突髓鞘完整，未见脱髓鞘病变(图2)。
4-AP-3-MeOH组大鼠残余髓鞘面积百分比为0.56%±0.06%，与生理盐水组为0.42%±0.05％相比，差异具有统计学意义(t=4.44，P=0.001)。
讨论
一、大鼠活体内应用4-AP-3-MeOH的可行性
近年来药物干预成为治疗脊髓损伤的重要手段。4-AP作为经典的钾离子通道阻滞剂在科学研究和临床实践方面都已证实其能有效的改善脊髓损伤后轴突的传导功能，从而对脊髓损伤的恢复发挥了重要作用[20,21]。但因其导致诸多不良事件的发生，限制其广泛应用尤其在慢性脊髓损伤方面。本实验首次使用新型钾离子通道阻滞剂4-AP-3-MeOH于活体大鼠尾静脉注射方式治疗大鼠慢性脊髓损伤，结果发现长期治疗后大鼠运动和感觉功能明显恢复。
4-AP-3-MeOH作为4-AP的新型衍生物，日益成为脊髓损伤药物治疗的热点。Sun等人[22]研究在离体脊髓损伤后局部采用不同浓度的4-AP-3-MeOH治疗，结果发现100 μmol浓度的药物可以显著恢复脊髓损伤后的动作电位。同时结合文献[23]体外药物有效浓度高于体内有效药物浓度数百倍，因此本实验采用1 μmol(1000 μmol/L×1ml)药物浓度首次在大鼠活体内尾静脉注射治疗慢性脊髓损伤，并参照Haghighi等人[24]对慢性脊髓损伤的治疗周期，我们在造模4周后每天尾静脉注射4-AP-3-MeOH，连续注射4周。
二、应用4-AP-3-MeOH治疗大鼠慢性脊髓损伤的作用
(一)大鼠行为学功能的恢复
大鼠运动行为学功能评价不仅可以直接衡量脊髓损伤的程度及再生修复的情况，同时也是构成药物疗效试验重要环节[25]。BBB评分法作为一种开放场地试验的神经运动功能评价方法，广泛应用于脊髓损伤实验的研究，尤其是低位胸段脊髓损伤后运动功能评价[17]。该法不仅能够详细评价脊髓损伤后肢中所有行为变化，揭示脊髓损伤恢复的全过程，同时具有较高的灵活性和可重复性，逐渐成为脊髓损伤运动功能评价的金标准[26]。但该法评价标准较为复杂。而斜板试验设备简单可操作性强且与脊髓损伤程度相关性高，但是无法评价大鼠的细微运动功能改变[18,27]。研究证实将两种方法结合评价可以弥补单一方法的不足，有效的提高评分的准确性和敏感性[19,28]。因此本实验采用BBB评分联合斜板试验评价脊髓损伤后大鼠运动行为学功能的恢复情况，结果发现4-AP-3-MeOH治疗组和生理盐水对照组在造模4周后BBB和斜板评分差异无统计学意义。说明两组大鼠造模成功并提示大鼠脊髓损伤后具有一定的自愈恢复能力。治疗组大鼠在用药2周后BBB评分(16.00±0)分高于对照组(14.83 ± 0.41)分，且继续治疗两周后，治疗组大鼠BBB评分(7周、8周)均高于对照组大鼠。但是治疗组大鼠BBB评分从第6周起保持在16分，至治疗用药结束。而对照组BBB评分保持在15分，根据BBB评分标准[17]15分与16分差异表现在伸趾的频率及优势爪触地时与身体的关系，而斜板试验主要评价大鼠在斜板上保持身体平衡的能力，因此大鼠这种细微改变无法通过斜板试验反应，故在本实验斜板试验结果中，我们发现4-AP-3-MeOH组和生理盐水组的斜板角度从造模后到第8周逐渐增加，但组间均无统计学差异。
(二)大鼠神经电生理的恢复
神经电生理检测作为一种客观反映神经传导功能的方法，不仅可以弥补单纯使用行为学检测的局限，同时可以敏感检测神经传导功能情况[29,30]。本实验采用SEP联合MEP可以详细观察大鼠脊髓损伤后感觉和运动功能恢复情况。神经电生理检测时潜伏期易受影响且脊髓损伤后波幅变化比潜伏期更敏感，同时波幅变化更为简单直观容易识别和分析[31,32,33]，故SEP和MEP仅选择波幅值作为评价指标。实验中发现治疗组在4-AP-3-MeOH治疗1周后SEP和MEP波幅值均出现升高并高于对照组波幅值(P< 0.05)，至第八周时，治疗组SEP波幅值平均较治疗前(四周时)提高2.38倍，而MEP波幅值平均提高1.48倍。这种SEP波幅值上升幅度明显高于MEP波幅值上升幅度的现象说明大鼠脊髓损伤药物治疗后，感觉功能恢复优于运动功能恢复，这一点也与大鼠行为学改变相一致，即运动功能没有明显改善(结果仅BBB少许升高但有统计学意义，斜板升高无统计学意义)。感觉诱发电位信号主要经脊髓后索传导，而支配肢体运动的锥体束主要分布在脊髓的侧索和前索。因此SEP和MEP恢复的情况不一定相同。对于脊髓损伤来说，运动功能的恢复较感觉功能恢复更为重要。
(三)大鼠组织学的改变
研究报道[34,35]神经电生理检测与组织学改变相一致，尤其是MEP。本次实验组织学检查也证实了这一点，同时研究发现大鼠脊髓损伤治疗后神经电生理功能恢复早于行为学功能恢复，这与相关文献报道一致[36]，这近一步证明损伤后的神经元和髓鞘具有一定的修复能力。实验大鼠组织学LFB染色结果发现治疗组和对照组脊髓白质均出现脱髓鞘病变，但通过比较两组大鼠残存髓鞘面积百分比，我们发现治疗组残存髓鞘面积百分比多于对照组。当前关于4-AP-3-MeOH在体内的有效作用时间尚未得知，参照4-AP及其其他衍生物在体内药物有效时间最长不超过24h[37,-38]，结合治疗组大鼠脊髓残存髓鞘面积多于对照组，而治疗组和对照组除了治疗药物不同，其他处理方式均一致(脊髓损伤程度等)，因此我们推测4-AP-3-MeOH在治疗脊髓损伤的机制方面，除了阻断钾离子通道外，还可能存在其他作用机制即具有激活髓鞘再生的能力。
综上所述，本实验首次采用新型钾离子通道阻滞剂4-AP-3-MeOH全身应用于大鼠慢性脊髓损伤的治疗，通过行为学、神经电生理及组织学检查，结果证实4-AP-3-MeOH能够改善大鼠的神经传导功能，从而恢复感觉和运动功能。研究中我们未设置药物不同梯度治疗及其激活髓鞘再生机制的深入研究。我们将在此研究基础上明确药物治疗的给药剂量及频率，同时进一步探讨可能的分子机制。
参考文献（略）
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