信得科技猪病检测中心第七十四次发布:一起由测序分析纠正检测结果的案例

        本文通过一起真实的猪场检测案例，说明测序 分析是确认猪场发病病原的不可或缺的工具。 

        2016年12月某日，山东某猪场发生仔猪腹泻、部分神经症状，由于该场伪狂犬没有净化完全，猪场老板及技术人员根据临床表现怀疑伪狂犬发病，送检仔猪脑、肺、脾等病料至猪病检测中心验证是否有病毒性四大病的感染。

         本中心收到病料后立即使用常规PCR方法进行检测，初步判定猪瘟、蓝耳、圆环病原阴性，伪狂犬阳性，伪狂犬结果见图1.

        从图1可见，该样品S使用PRV gE特异引物扩增，扩增条带略高于阳性对照，根据该条带清晰无拖尾，处于合理的条带波动范围，初步确定该样品为伪狂犬阳性。

        为了更准确的出具检测结果，本中心对该样品进行基因测序。第一次送扩增样品显示无信号反应，第二次增加“胶回收、连接、转化、菌P鉴定”等步骤，挑单克隆菌通用引物测序。NCBI Blast显示，该扩增条带为猪基因组一段重复序列（gender-neutral repetitive，图2），并非伪狂犬病毒特征序列。

        为了确保检测结果的准确性，取脑、肺、脾脏等组织匀浆，适当稀释后接入长满单层的Marc-145细胞，孵育1h后更换维持液继续培养，4天收获第一代，冻融后继续接入细胞作为第2代，逐日观察细胞形态，直至第4天均未发现细胞空泡化等特征性病变（图3），收获第2代细胞培养液，PCR鉴定结果显示伪狂犬病原阴性。

        细胞培养检测结果：判定该样品为伪狂犬阴性。

        根据测序分析、细胞培养结果，本次检测PCR扩增条带并非有效特异扩增，对病原检测结果及时纠正为：伪狂犬阴性。

        猪场送检病料，考虑到时效以及成本，通常使用PCR手段进行检测，即使用病原特异引物扩增目的基因，根据扩增条带是否符合预期判定阴阳性。测序即通过分析目的基因片段的碱基序列，评估病原特征、疫苗使用程序等后续免疫治疗工作，也是检验结果是否准确的直接方法。

        对于猪场病原检测，结果的准确性关乎病猪是否妥善治疗、猪场经济效益能否上升等关键问题，病毒、细菌都有其独特的进化谱系，本中心推荐对病原检出阳性样品进行测序，一方面对本场发病病原特征进行了解，针对性治疗；另一方面可有效避免检测误差。