临床生化检验主要是研究疾病状态下人体内生物化学物质以及其指标变化的一门学科,是临床医学诊断中的一个很重要的分支,属于多学科的一个范畴,生化检验容纳吸收了化学、生物学、数学、病理学、生物化学等学科知识,为评估健康、病人治疗方案的制定、监测防御疾病的发生提供了重要信息。随着医疗技术的发展临床生化检验的分析方法也已经有了长足的进步,各种生物传感器、化学传感器的开发应用,使得项目分析方法从最早传统的分光光度分析法发展到免疫分析法再到干化学分析法变更加复杂多样,下面就生化检验项目的分析方法做概要介绍。
紫外可见分光光度法(Ultraviolet Visible Spectrophotometry,UV-Vis)是根据物质的分子对紫外可见光区辐射的吸收特性,对物质的组成进行定性或定量及结构分析的方法,属分子吸收。
根据光吸收的基本定律Lambert-Beer定律:
A=Kbc (2-1)
A为吸光度,K为吸收系数,b为溶液厚度,c为溶液浓度
可知其意义是,当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时,其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。
紫外可见分光光度法具有较高的准确度和灵敏度,仪器设备比较简单,方法可靠快速,在一些需要超高灵敏体系中比如医药卫生、食品检测、生命科学、工农业等领域的得到广泛的应用和关注。
紫外可见分光光度计主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统组成。
图2-1 紫外分光光度计简介
终点分析法是临床生化检验项目中最常用的分析法,分一点终点法和两点终点法。因为该分析法常有标准液,因此又称比例终点法,是经过一定反应时间后,当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。
一点终点法是在时间-吸光度曲线上吸光度不在改变时,选择一个时间点测定吸光度的值。通常在反应终点附近连续读两个吸光度,求出两点的平均值,并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。
计算公式:
C=(Am-Ab)*K (2-2)
Am为终点读书点的吸光度,Ab为试剂空白吸光度,K为校正系数
图2-2 一点终点法反应曲线
两点终点法是指在第二试剂加入以前,选择某一点读取吸光度Am,经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。
第一点吸光度值由样本本省或第一试剂与样品的非特异性反应有关,相当于样品空白,可有效的消除样品自身的吸光度,如溶血、脂血、黄疸等的干扰。
计算公式:
C=(An-K0*Am)*K (2-3)
K0为体积校正因子,K为校正系数
图2-3 两点终点法的反应曲线
连续监测法也叫速率法或动力学法。也就是连续检测反应过程(每15s~1min监测一次),根据测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。这种方法的好处是可以将多点的测定结果连成线,很容易找到成直线的区段,来计算酶的活性。
连续监测法分为直接连续监测法和间接连续监测法。
图2-4 连续监测法的测定时间与吸光度
这里的免疫学测定法一般指的是免疫比浊分析法。就是抗体与可溶性抗原结合反应形成一定结构的免疫复合物,并成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合微粒具有特殊的光学性质,可用于仪器检测。
免疫比浊分析又分为透射比浊测定法和散射比浊测定法。带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液都具有散射入射光的性质。当一束光线通过此种溶液受到光散和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱。在光源的光路方向测量透射光强度和被检溶液中微粒浓度关系的方法称为散射比浊测定法。
目前免疫比浊分析法会存在抗原过量导致测定结果明显低于实际含量的问题,针对这一问题,检测抗原过量的检测方法有以下4种。
1. 标本用两种稀释度测定。
2. 测定后的反应液中追加被检样品,浊度上升表示有多余抗体,反之,如浊度下降,可能为抗原过量。
3. 测定后的反应液追加抗体,继续观察浊度,浊度上升表示抗原过量。
4. 连续监测抗体抗原反应曲线,抗原过量时曲线异形。
图2-5 反应体系中抗原抗体浓度变化与抗原抗体复合物关系
干化学(Dry Chemistry)又称干试剂化学,属于固相化学范畴,它指的是将液体样品(血清、血浆、全血、尿液等)直接加到已固化于特殊结构的试剂载体即所谓干式化的试剂中,以样品中的水为溶剂,将固化在载体上的试剂溶解后再与样品中的待测成分进行化学反应,从而进行分析测定的一种方法。
干化学检测项目的试剂也叫干片试剂,从上到下一般分为分布层、辅助层、试剂层和支持层。其中辅助层主要包括:反射层和清除剂层。
图2-6 干片试剂示意图
将待测样品定量加到干片试剂上,再由分布层把定量样品均匀的展开,并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质等进入试剂层。而样品中的水分子会成为干试剂的溶剂,试剂与带测物质进行化学反应,在辅助层的作用下,产生的化学产物会在显色层与显色试剂一起呈显色反应。而支持层只是一透明的胶片,只是起到支撑干片试剂的作用。整个过程经过一个特定的时间,由反射光度计进行检测分析,光度计的单色光透过支持层、显色层、试剂层,一部分的光线会被吸收,另一部分的光线则会反侧到接收器被检测。待测物的浓度越高,光线被吸收的就会越多,检测到的反射光也越弱,因此,待测物的浓度与吸光度是成正比的关系。
图2-7 单色光透过试剂干片
干化学目前是即时检验的核心。干试剂片可进行全血的检测、无需定标、干片保存也方便,检测速度快,准确性和重复性好,所以特别适合临床实验室的急诊检验做急诊生化的检测。
生化分析仪是临床实验室中常用的也是非常重要的诊断仪器之一。它是通过对血液和其他体液的分析来测定各种生化指标,主要分为肝功能、肾功能、心肌疾病、血脂、糖类、特定蛋白、电解质等。并结合临床进行综合分析,可帮助临床医生诊断疾病,为制定治疗方案提供了重要信息。
世界上第一台全自动生化分析仪由美国Technicon公司于1957年推出,标志着医院的临床生化检验正式迈入自动化时代。全自动生化分析仪,从加样至结果的全部过程完全由仪器自动完成,操作者只需将样品放在分析仪的指定的进样位置,设定好程序开动仪器即可等待检验结果出来。
按照反应装置的结构,全自动生化分析仪主要分为流动式、分立式两大类。
1. 流动式:指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这也是第一代自动生化分析仪。
2. 分立式:各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成、其中有两个分支。
(1) 典型分立式自动生化分析仪。此型号应用最为广。
(2) 离心式自动生化分析仪,每个待测样品都是在离心力的作用下,在各自的反应槽内与试剂混合,完成化学反应并测定。
3. 袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯,每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定结果。
4. 干化学式自动分析仪是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上,每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应测定。
流动式分析仪的整套仪器是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器这几个部件组成。
图2-8 流动式分析仪结构图
流动式分析仪的优点:
1. 自动吸样、自动加试剂能避免人工污染
2. 自动计算浓度值
3. 自动孵育
流动式分析仪的缺点:
1. 只能同时测定一个标本
2. 测试速度慢
3. 需人工清晰孵育盘
现在国内中高档的全自动生化分析仪基本都是分立式分析仪,比如:日立、贝克曼、东芝等,它最大的特点就是速度快、交叉污染小、能同时测定多个项目。它与流动式分析仪最大的区别就在于分立式各个样品和试剂在各自的试管中反应,而流动式是在同一个管道中反应的。
图2-9 日立7180分立式全自动生化分析仪
离心式分析仪是1969年才发展起来的一种分析仪,它的特点是化学反应器装在离心机的转子位置,也叫转头,先将样品和试剂分别置于转头内,当离心机转动后,圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应,最后流入圆盘外圈的比色槽内进行比色检测。
图2-10 离心式分析仪结构
半自动生化分析仪是指在分析过程中的部分操作(如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤)需手工完成,而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小,结构简单,灵活性强,可以分开单独使用,也可以与其他仪器配套使用。
半自动生化分析仪的优点是,一是可以直接计算测定项目的含量,免除人工计算.二是可实时监测测定物的吸光度变化,可测定酶法.不足就是需要人工加样,机外孵育标本,测定结果的误差很大。
图2-11 上海科华半自动生化分析仪
干式生化分析仪在20世纪80年代由Eastman Kodak公司推出,配套的干式试剂片能测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等项目。当加上定量的血清后,在干片的前面产生颜色反应,用反射光度计检测就可以进行定量检测。干化学的长足进步也是这近20年的事,源于蛋白质即酶分离、提纯、保存技术的进步,传感器积分球即反射光度计和微电极的发展以及电子计算机的应用。
干式化学的主要特点是:快速、准确、精密。与普通的湿生化分析仪相比显色反应发生的方式和容器是干式生化分析仪与普通湿生化分析仪最主要的不同点,相应的两种生化分析仪的光路系统也有所不同。普通湿式生化分析仪一般是在比色杯中发生显色反应,此外,还采用光电比色法进行分析,其吸光度与被测溶液浓度满足朗伯-比尔定律。干式生化分析仪测完全抛弃了传统的管路系统,使用的是干试剂条作为固相试剂,干试剂条一般是由多层薄膜组成,以美国强生公司的V350干式生化分析仪使用的干试剂条为例,第一层是分布扩散层,能使标本均匀分布,第二层是试剂层,第三层是指示试剂层,包含染料以产生显色复合物。
干式生化与湿式生化的测试结果方面,两种方法所有分析项目的R(相关系数)均大于0.93,相关性检验P<0.05.统计结果表明两种仪器的分析结果相关性良好。质量控制与结果校准方面,两种生化分析都可以利用厂家配套的质控品和校准品进行质量控制或校准,但是实际工作中,由于干式生化分析仪的质控品价格较高并且不能反复冻融,所以,一般采用先在湿式生化仪上测定出值后再到干式生化仪上进行质控检查。
即时检测,也称床旁快速检测,英文为:Point of Care Testing(POCT)是体外诊断的一个子行业,指在患者身边进行现场采样检查并分析,快速得到检验结果,省去标本预处理、样本送检、设备检测、数据处理等步骤,使检测、诊断、治疗成为一个连续过程,对于疾病的快速发现和最早治疗具有重要意义,
这种便携式即时生化仪有以下几个优点:
1. 快速、即时、检测时间短、出结果快。
2. 可以在病人床边、身边、患者身边进行检测。
3. 操作简便、携带和使用都很方便。
但是缺陷也很突出,一是检验成本偏高,二是质量控制体系不完善、三是操作者技术水平参差不齐,四是检测项目少。最主要的一点就是检测结果的准确性和仪器的重复性还亟待突破。
微流控技术是近年才发展起来的一门新兴交叉学科。微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术,是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征,微流控装置通常被称为微流控芯片,也被称为芯片实验室(Lab on a Chip)和微全分析系统(micro-Total Analytical System)。
针对POCT生化分析仪的应用需求,将微流控技术与生化分析技术相结合发展出了微流控芯片生化分析仪。具备体积小、易操作、多指标、高性能、自动化等特点。其检测原理和湿法的大型全自动生化分析仪相同,都是基于光电比色法和朗伯-比尔定律对物质进行定性定量分析。
室内质量控制简称室内质控,英文为:Internal Quality Control (IQC),是各个实验室为了检测和评价本实验室的工作质量,以确定检验报告能否发出而做出的一系列检查、控制的手段,包括实验室工作的全部过程,旨在检测和控制本实验室常规工作的精密度,并检测其准确度的改变,提高实验室常规工作中批间和日间标本检测的一致性。狭义的室内质控主要是指从样本采集、预处理、仪器和试剂的校准与定标、操作直到读取检验结果等整个分析过程和测量系统的质量控制,从广义上来讲,质量控制主要涉及分析前、分析中、分析后这三个阶段的控制。
1. 分析前阶段:病人准备、标本采集、标本保存和运输。
2. 分析中阶段:建立项目操作程序、试剂、质控物的质量要稳定、仪器校准调试。
3. 分析后阶段:检测报告正确发出、临床咨询服务、室内质控资料管理、参加室间质评。
室内质控和室间质评是临床实验室实施实验室质量保证的重要组成部分。室间质评,英文为:External Quality Assessment(EQA)是指多家实验室分析同一标本,由外部独立机构分析和反馈实验室的检测结果,用于评定实验室常规工作的质量,观察实验的准确性,建立各实验室之间的可比性。
随着近几年医疗技术的不断发展和进步,自动化的分析仪器在临床广发应用,生化检验结果的准确性和重复性也有了明显的提高,但是在做质量控制的时候还是有很多不足之处亟需改进。
未完待续...